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微小RNA(miRNA)是一类能够用于早期和预后诊断的肿瘤标志物。体液中循环miRNA提供了理想的非侵入式检测的肿瘤标志物。因此,循环miRNA检测对于肿瘤早期诊断具有重要的研究意义。DNA纳米机器是一种将化学能转化为机械能的自组装超结构。其中,DNA步行者,可以实现DNA在一维、二维或三维轨道上的行走,是近期DNA纳米机器的研究热点。微球悬浮阵列提供了优于平面阵列的核酸多元分析平台。以miRNA快速、灵敏、多元检测为研究目标,本论文构建了量子点荧光编码微球(Qbead)平台,进一步在Qbead表面完成了靶标触发、DNA呼吸介导的DNA快速行走,从而发展出了Qbead-DNA行走一体化的核酸分析方法,成功用于了正常人/非小细胞肺癌患者血清样本中5种循环miRNA的同时检测。论文的主要研究内容如下:1.“核-壳-壳”结构Qbead的可控制备。制备过程由5步顺序完成:St?ber法和种子生长法制备二氧化硅核;吸附绿色油溶量子点;St?ber法包覆第一层硅壳;吸附红色油溶量子点;St?ber法包覆第二层硅壳。通过调控绿/红量子点的比例,实现了5种Qbead荧光编码。该“核-壳-壳”结构Qbead具有高的荧光稳定性。2.均相条件下靶标miRNA触发的DNA级联回路。链取代回路I:靶标miRNA打开DNA步行者茎环结构,导致后者与引物杂交,引发Bst聚合酶催化的链取代反应,产生双链DNA,实现靶标miRNA的循环利用。链取代回路II:双链DNA产物在60°C条件下发生呼吸作用产生不稳定的单/双链混合结构,导致其与引物杂交,引发链取代反应。链取代回路III:外加另一引物Pe,双链DNA产物不稳定结构也会与其杂交,并引发链取代反应。该链取代回路I、II和III组成的DNA级联回路实现了靶标miRNA的循环利用和双链DNA大量合成。3.Qbead-DNA行走一体化miRNA分析方法。将DNA引物固定于Qbead表面作为行走轨道,DNA步行者和引物Pe均标记生物素,靶标miRNA和Bst聚合酶存在条件下,可实现DNA沿三维轨道的快速行走,在Qbead表面产生大量生物素标记的双链DNA。该生物素标记的双链DNA可通过链霉亲和素修饰的染料进行标记,从而用于荧光法表征。荧光显微镜结果显示,Qbead表面的DNA行走快速、高效,优化行走时间为30 min;Qbead表面的DNA行走与靶标浓度密切相关。流式细胞术结果表明,Qbead-DNA行走一体化方法实现的miRNA检测限为5 copies/μL,线性动态范围达4个数量级。4.血清样本循环miRNA的快速、灵敏、多元检测。基于制备的5种荧光编码,Qbead-DNA行走一体化方法用于了正常人和非小细胞肺癌患者血清样本5种miRNA的流式细胞术分析。结果表明,相比于正常人血清,非小细胞肺癌患者血清中miRNA-29a和miRNA-151-5p的表达上调;miRNA-15b的表达保持稳定;miRNA-26b和miRNA-15a的表达下调。