疟疾依然是严重危害人类健康的传染病之一，全球每年有3～5亿临床病例，100～300万人死于该病，其中大部分是儿童。特别是近几年来由于抗药性疟原虫虫株及抗杀虫剂蚊媒的产生及蔓延，传统防治疟疾的方法受到新的挑战，因此研制一种有效的疟疾疫苗是疟疾防治的重要替代途径。在疟原虫复杂的生活史中，只有红内期是致病的阶段，因此，红内期疫苗的研究备受关注。在众多的疟疾候选抗原中，高度保守的裂殖子表面蛋白1(Merozoite Surface protein 1，MSP-1)C末端19kD片段(MSP1-19)和裂殖子顶端膜抗原1(Apical Membrane Antigen 1，AMA-1)是目前两个最有希望的红内期亚单位疫苗。我们实验室已经成功构建了由MSP1-19和AMA-1的Ⅲ亚区[AMA-1 (Ⅲ)]通过接点序列连接而成的融合蛋白，定名为PfCP-2．9，它由毕氏酵母高水平分泌表达。以Montanide ISA720为佐剂，PfCP-2.9能诱导家兔及猴子产生高水平的抗体滴度，动物免疫血清体外能抑制裂殖子入侵红细胞。目前该疫苗已经获准进入临床试验。本研究探讨了不同遗传背景小鼠和不同佐剂对融合蛋白PfCP-2.9免疫效应的影响，并对该疫苗的稳定性和效力进行了实验研究。 5种品系小鼠，其中近交系小鼠4种，远交群昆明小鼠1种，以ISA720为佐剂皮下免疫3次，以酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光抗体实验(IFA)检测免疫血清中特异性抗体水平。结果发现，5种品系小鼠都能产生针对PfCP-2．9的免疫应答，三次免疫后血清中特异性抗体滴度达10~5以上，而且免疫血清能识别疟原虫天然抗原。所诱导的四种IgG抗体亚型中，IaG1和IgG2a是免疫血清中主要的抗体类型，与之同时，免疫血清中也能检测到IgG2b和IgG3的存在。但特异性抗体滴度、抗体亚型及对天然抗原的识别情况，因遗传背景不同而出现差异。KM及BALB/ca小鼠免疫反应明显强于其他品系小鼠，但以IFA检测免疫血清中抗疟原虫天然表面蛋白的抗体却以昆明小鼠最低，BALB/ca小鼠仍为最高。 在上面实验的基础上，选择了BALB/ca和C57BL/6J两种品系小鼠及新西兰大白兔比较不同佐剂对PfCP-2.9免疫效应的影响。PfCP-2.9蛋白分别与氢氧化 第二平医人学硕L似大生学位论文铝佐剂、弗氏佐剂及ISA720佐剂混合乳化后免疫动物，测定免疫血清中特异性抗体水平及抗体亚型，分析免疫小鼠脾细胞在抗原刺激下的增殖情况及细胞因子分泌量，综合评价PfCP－2．9不同佐剂免疫后的体液免疫和细胞免疫，并通过家兔免疫血清体外抑制试验评价疫苗的保护性。结果发现，动物免疫血清的抗体水平、IgG抗体亚型、原虫体外抑制率、脾细胞增殖情况及细胞因子分泌量因遗传背景和佐剂的不同而存在明显差别。 与不同品系小鼠免疫结果一致，BALB儿a小鼠三种佐剂免疫组的抗体水平均比对应C57BL／6小鼠强。而且，两种品系小鼠的弗氏和 ISA720佐剂免疫组的特异性抗体及抗体亚型水平均明显比相应的氢氧化铝佐剂免疫组高。其中BALB／ca，J＼鼠以弗氏佐剂免疫组最高，而C57BL／6 小鼠以ISA720 佐剂免疫组最高。PfCP－2．9三种佐剂家兔免疫比较发现，ISA720和弗氏佐剂免疫组的家兔免疫血清能强烈的抑制疟原虫体外生长，裂殖子入侵抑制率分别为 98．31％和 96．33％，而氢氧化铝佐剂免疫组免疫血清基本不能抑制疟原虫生长，抑制率仅为35．31％。 与对照组相比，免疫组小鼠的脾细胞在抗原的刺激下能产生明显的增殖反应，但不同性剂免疫组反应不同，弗氏和 ISA720佐剂免疫组小鼠的增殖实验明显强于氢氧化铝佐剂免疫组和无住剂免疫组。ISA720佐剂免疫组小鼠脾细胞对wo－2．9及其各组分均能产生明显的增殖反应：弗氏佐剂免疫组与工“72O佐剂免疫组相似：氢氧化铝佐剂免疫组与无佐剂免疫组小鼠脾细胞对灿M－1（m）和MSPI－19的刺激增殖反应不明显，甚至不发生增殖反应。PfCP－2．9抗原刺激后的免疫小鼠脾细胞培养液上清能检测到 几一4及 FN－Y 细胞因子的分泌。其中IFN－Y分泌量以ISA720佐剂免疫组最高，其次为弗氏佐剂免疫组，再次为无佐剂免疫组，最后为氢氧化铝性剂免疫组；而IL－4分泌量以弗氏佐剂免疫组最高，其次为ISA720佐剂免疫组，再次为氢氧化铝佐剂免疫组，最后为无住剂免疫组。 在上面实验的基础上，我们进一步分析PfCPZ．9免疫血清对其组分的识别情况，与预期结果相一致，免疫血清能检测到高水平的针对 AMA－1（111）和 MSPI－19两个片段的特异性抗体，但针对连接区片段的抗体很少，甚至不能检测到特异性抗体的存在。 此外，我们还分析了保存条件对该疫苗的效力及其稳定性的影响。结果表明，4℃保存12个月的疫苗样品中的抗原成分没有降解，仍然保持其原有的抗原性和 3 第二军医大学硕士州究生学位论文免疫原性。家兔免疫血清仍能有效地抑制疟原虫体外生长。效力实验结果显示：引起半数动物免疫反应的疫苗剂量u。＊为0对引土0刀12卜g