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肾癌又称肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)、肾腺癌,是起源于肾小管上皮系统的恶性肿瘤。其发病率在泌尿系肿瘤中仅次于膀胱癌,而在肾癌中以透明细胞癌最多见。肾癌治疗目前仍以外科手术切除为主,对放疗不敏感,虽然已有肾癌靶向性药物的问世,但其耐药、价格昂贵等因素存在,因此寻求更有效的治疗手段非常必要。近年来,对基因治疗的应用研究逐渐成为肾癌特别是中晚期肾癌新疗法的研究热点。Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族新成员,其在多数恶性肿瘤组织中表达丰富,但在正常成人组织中不表达或极少表达,这种选择性表达特性使其可能成为恶性肿瘤诊断的标志物和基因治疗的新靶点。在我们的前期研究中,利用RNAi技术,构建重组质粒并转染入786-0细胞,显著抑制了survivin基因的表达,诱导了细胞的凋亡,从体外研究了以survivin为靶向的RNAi治疗肾癌提供了可靠的实验室依据。本实验在证实人肾癌786-0细胞株表达survivin的基础上,利用RNAi技术在体内抑制survivin基因的表达,进一步为肾癌基因治疗提供实验室依据。第一部分survivin基因在人肾癌786-0细胞中的表达与意义目的:检测人肾癌786-0细胞中是否有survivin基因表达,探讨survivin基因在人肾癌786-0细胞中表达的意义。方法:1.培养人肾癌786-0细胞。2.RT-PCR检测survivin mRNA在人肾癌786-0细胞中的转录水平。3.Western-blot检测survivin蛋白在人肾癌786-0细胞中的表达水平。结果:1.RT-PCR显示人肾癌786-0细胞中有survivin mRNA表达。2.Western-blot显示人肾癌786-0细胞中有survivin蛋白表达。结论:在人肾癌786-0细胞中survivin基因在mRNA及蛋白质水平都有表达,提示survivin基因与人肾癌的发生发展密切相关,为以survivin为靶向的人肾癌基因治疗奠定了基础。第二部分靶点特异性的survivin基因siRNA重组质粒的构建及扩增目的:根据survivin基因在GenBank中的序列,以及在我们的前期研究基础上构建特异性的siRNA重组干扰质粒,并扩增及鉴定。方法:1.根据survivin基因在GeneBank中的序列及我们的前期研究构建二组阳性siRNA和一组阴性对照,其转录模板与pGenesil1.1连接并转化入大肠杆菌DH5α菌株。2.挑选卡那霉素抗性菌落并扩增培养。3.对扩增的重组质粒鉴定。结果:成功得到二组阳性siRNA(survivin1 5′-GGACCACCGCATCTCTACA-3′166 ; survivin2 5′-GGCTGGCTTCATCCACTGC-3′241)和一组阴性对照( HK 5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′)。结论:在体外合成的针对survivin的siRNA为下一步抑制人肾癌786-0细胞移植瘤中survivin的表达提供了基础。第三部分靶向survivin的siRNA在体内对人肾癌裸鼠移植瘤的抑制作用目的:BALB/c裸鼠皮下注射786-0细胞悬液,建立裸鼠人肾癌移植瘤模型后,于瘤体内注射survivin siRNA,观察survivin siRNA在体内对肿瘤生长状况的影响。方法:1.建立裸鼠人肾癌移植瘤模型。2.采用瘤体内5点注射法,于瘤体内注射survivin siRNA,根据注射survivin siRNA的不同,将裸鼠随机分为8组[A( survivin1 siRNA+脂质体+纯RPMI1640);B( survivin2 siRNA+脂质体+纯RPMI1640);C (HK siRNA +脂质体+纯RPMI1640);D( survivin1 siRNA+纯RPMI1640);E( survivin2 siRNA+纯RPMI1640);F(HK siRNA +纯RPMI1640);G(脂质体+纯RPMI1640);H(生理盐水)]。3.用游标卡尺测量、并计算移植瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,最后剥瘤称重。4.HE染色各组裸鼠移植瘤、肝脏和肾脏组织。5.采用RT-PCR、Western-blot检测注射后移植瘤组织survivin mRNA和蛋白表达情况。6.TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况。结果:1.成功建立裸鼠人肾癌移植瘤模型。2.移植瘤生长变化:通过测量、计算移植瘤体积,绘制移植瘤生长曲线。发现从肿瘤接种后的第19天开始至接种后28天,A、B组肿瘤体积显著小于C、D、E、F、G、H组,P<0.05。接种后28天剥瘤称重, A、B组肿瘤组织重量显著轻于C、D、E、F、G、H组,P<0.05。3.HE染色光镜观察移植瘤均为肾透明细胞癌,各组肾脏、肝脏均无明显病理组织学异常。4.RT-PCR扩增后显示:A、B组移植瘤组织中survivin mRNA的表达较C、D、E、F、G、H组明显下调,P<0.05。5.Western-blot检测移植瘤组织survivin蛋白表达:结果A、B组移植瘤组织中survivin蛋白的表达明显弱于C、D、E、F、G、H组,P<0.05。6.移植瘤细胞凋亡情况:TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡指数,结果A、B组移植瘤组织中细胞凋亡明高于C、D、E、F、G、H组,P<0.01。结论:在体外合成的针对survivin的siRNA在体内能有效抑制人肾癌786-0细胞移植瘤组织survivin mRNA及蛋白的表达、促进移植瘤细胞凋亡、抑制移植瘤生长。