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绿僵菌(Metarhizium anisopliae)又名黑僵菌,是一种常见的丝状真菌,有着广泛的地理分布,也是国内外生物防治中应用广泛的昆虫病原真菌之一。绿僵菌具有一定的专一性,对人畜无害,同时还具有不污染环境、无残留、害虫不会产生抗药性等优点。随着绿僵菌基因组测序的完成,使其更成为一种研究虫生真菌的模式生物。迄今,关于真菌的致病机制的研究广泛,而关于虫生真菌致病相关基因的研究亦十分活跃。这是由于绿僵菌致病力弱,货架期短,环境依赖性强严重制约了绿僵菌杀虫真菌农药的发展。致病基因、耐胁迫基因的研究将为菌株改造提供基因资源。本实验从绿僵菌CQMa102在蝗虫翅膀生长时期与在蝗虫体内生长时期的差减cDNA文库中选取了一个高表达基因EST序列,WTEA78。根据这个EST序列,我们从绿僵菌全长cDNA文库中克隆了这个基因Mzbot,该基因cDNA序列全长1251bp,与费希新萨托菌的zinc-binding oxidoreductase ToxD基因具有较高的同源性,同时利用RNAi和超表达的方法,通过减少或增加基因的表达量后绿僵菌变异表型,研究了Mzbot的功能。得到的主要实验结果如下:1.绿僵菌Mzbot基因的克隆、序列分析和表达情况克隆了蝗虫翅膀上特异高表达基因Mzbot的cDNA全长,进行了生物信息分析,并通过RT-PCR对其侵染蝗虫过程中的表达模式进行了分析。Mzbot基因cDNA片段全长1251bp,包括一个1089bp的开放阅读框,69bp的5’非翻译区,93bp的3’非翻译区。该cDNA序列的Genebank accession number为HQ011919。与绿僵菌CQMa102全基因组序列比对,获取了Mzbot基因的基因组DNA序列。将DNA序列与cDNA序列用DNAMAN软件比对,结果表明:Mzbot基因组DNA全长1478bp,含有4个外显子和3个内含子,内含子位置为(283bp-381bp、661bp-715bp、800bp-866bp),其边界皆符合GT-AG规则。在线预测该基因编码362个氨基酸,预测蛋白质分子量Mw=39336.81u (当Cys处于还原状态时);理论等电点pI=5.41属于酸性蛋白质;其分子式为C1786H2772N456O530S7;负电荷残基(Asp + Glu) 47个,正电荷残基(Arg + Lys)39个,平均亲水性(GRAVY): -0.135,是一个亲水蛋白;不稳定指数(Instability index )19.67,为稳定的蛋白质。同费希新萨托菌的zinc-binding oxidoreductase ToxD基因具有较高的同源性(51 % identity,E-Value值为6e-85)。与其他真菌已知或推测的zinc-binding oxidoreductase ToxD也有较高的同源性。在线分析推测编码蛋白不含有信号肽,没有定向到线粒体的导肽,也没有核定位信号Nuclear LocalizationSignals (NLS),定位在细胞质。生物信息学预测表明该蛋白没有显著的跨膜结构区域,这与生物信息学定位一致,在163位氨基酸处(NKTV)有一个N-糖基化位点(N-glycosylation site);在12与223位氨基酸处(RKAT)各有一个cAMP-与cGMP-依赖的蛋白激酶磷酸化位点;在195、242、251位氨基酸处(SSK)各有一个蛋白激酶C磷酸化位点;在27位(TLPD)、48位(TTLD)、67位(TVEE)、159位(SQDD)、217位(TVGE)、269位(SDVE)、298位(TYYE)分别具有酪蛋白激酶II磷酸化位点;在57位(GTLVGC)、91位(GGNDAR)、170位(GGSTAT)、255位(GTYVNL)、329位(GGLIGV)各有一个N-豆蔻酰基化位点。结构域分析预测表明该基因编码的假定蛋白zinc-binding oxidoreductase ToxD N-端具有一个GroES-like功能结构域,在C-端具有NAD(P)结合功能结构域。这两个功能结构域在所有的ToxD蛋白中都具有,是一个突出的特征。这一点预示了基因编码蛋白的氧化还原特性,可能参与了生命体的抗氧化保护机制。RT-PCR检测该基因在绿僵菌侵染蝗虫过程中的表达情况,结果显示该基因在体内、体外两个侵染阶段存在比较大的表达差异。28℃恒温恒湿的条件下,在绿僵菌侵染蝗虫体表15h后该基因持续而强烈的表达,而绿僵菌在蝗虫血淋巴中该基因表达甚微。推测该基因的主要作用可能是绿僵菌适应蝗虫翅膀环境,可能与抵抗胁迫因素有关。2.绿僵菌Mzbot基因的干扰、超表达和在突变株中的表达情况利用RNAi和超表达的方法对基因Mzbot进行功能研究。干扰片段连接至RNA干扰载体(pbar-RNAi-gpd-trp)和全长基因连至超表达载体后,采用电转化的方法转化绿僵菌CQMa102,经过PPT(草丁膦)和PCR筛选鉴定,各获得4个Mzbot基因的干扰突变株和超表达突变株。采用RT-PCR的方法检测各个突变株中Mzbot基因的表达情况。分析结果显示,干扰突变株和超表达突变株中的该基因的表达均有较大的变化,选取其中变化最大的突变株作了进一步表型分析。3.绿僵菌Mzbot基因的干扰、超表达后的表型变异分析分析了干扰突变株和超表达突变株在1/4SDAY培养基上的菌落形态。在正常培养基1/4SDAY上,干扰突变株菌落呈现中央同菌落四周断裂的表型,而野生菌株与超表达菌株均呈现中央凸起的菌落表型,且野生株与超表达菌株菌落没有可见的明显差异。这可能是Mzbot基因对氧化压力的调控导致了菌落表型的变异,ROS的水平变化发挥了重要作用。对两种突变株进行了抗逆性分析,两种突变株在不同的pH和渗透压条件下,菌落表型与野生株没有明显差异,而抵抗氧化压力的能力与野生株具有显著的差别,干扰突变株的生长受到更厉害的抑制,而超表达突变株表现了更强的对氧化的抗性。这表明,Mzbot基因参与了绿僵菌CQMa102对氧化压力的抗性,而没有影响菌株对pH和渗透压的抗逆能力。对两种突变株孢子的毒力进行了生物测定,干扰突变株的LT50和野生株的LT50差异极显著(P<0.01)。表明Mzbot基因的干扰影响了绿僵菌CQMa102的毒力,因此Mzbot基因对绿僵菌CQMa102的毒力有一定的贡献。可是超表达Mzbot并没有利于毒力的改善,表明在真菌与宿主互作中的其他因素构成了改善毒力的限制因子。