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在传统的治疗手段渐渐不能满足治疗疾病的今天,基因治疗则成为一个新的治疗癌症的选择,同时寻找一个理想的基因治疗载体也成为了目前基因治疗研究中不可或缺的一个重要方向。AAV病毒作为携带基因治疗的载体,1)具有安全性好,没有明显致病性,2)不能自主复制,3)宿主范围广,4)可长期表达外源基因,并且5)特异性的整合到人19号染色体上等优点而成为目前基因载体研究中的重要的基因携带载体,同时也是基因治疗众多基因治疗载体中最具潜力载体之一。但也正是由于其宿主范围广,也导致了其对组织或细胞没有特异性,导致AAV介导的基因治疗对靶细胞的感染效率低。因此提高AAV病毒感染目的细胞的效率和AAV病毒转运组织的靶向性,是改造AAV病毒的关键。越来越多的研究文献表明目前改造AAV病毒靶向性主要通过以下几种方法：1)单纯的化学修饰,2)外壳基因插入删除改造,3),交换不同血清型AAV之间的营救标记区域以及4)产生嵌合型基因载体等。其中通过实验产生嵌合型的基因载体定向进化成为靶向某一组织或者某一细胞的新型AAV是目前改造AAV病毒趋向性的手段之一。本文就是采用DNA shuffling的方法,将九种不同来源的亲本型AAV病毒AAV1-AAV9通过PCR方法扩增出衣壳基因cap片段,通过DNaseI酶随机酶切,琼脂糖电泳后割胶回收100-300bp大小片段,试验了两种不同的shuffling PCR方法,结果显示用随机酶切产物直接作为PCR模板的方案特异性条带不明显,而使用用无引物PCR和有引物PCR结合的方法则能较好的扩增出2300bp左右的特异性条带,将PCR产物回收酶切以后连接到笔者自己构建的带有致死基因CCDB的病毒包装载体pARC上,产生一系列不同亲本型来源的嵌合型AAV基因的质粒pAdL,以此构建AAV随机的衣壳基因文库。在此基础上,利用对AAV文库基因包装病毒,建立嵌合型AAV病毒文库,利用文库病毒在体外对AAV病毒进行定向进化,筛选获得一种能够靶向乳腺癌细胞的病毒。经过重复三轮感染以后发现一种能够靶向乳腺癌细胞sk-br-3的新型AAV病毒,通过基因比对发现这种新型的嵌合型AAV病毒AAV-Y与AAV1, AAV2, AAV7, AAV8具有同源性。在进一步研究该病毒对肿瘤细胞的感染能力的实验中我们还发现,用相同浓度的AAV-Y病毒感染肝癌细胞BEL-7721,则几乎没有感染能力,而对乳腺癌细胞sk-br-3具有一定的感染能力,为以后进一步研究AAV-Y病毒的功能打下了基础。同时也证明了本研究中所设计的文库构建以及病毒筛选具有很强的可行性,所构建的文库能够满足本实验室定向进化其他组织细胞的要求,也为了以后AAV载体改造靶向基因治疗提供了基础。