河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一类危害人类健康的天然神经剧毒物质。其强毒性及在医学、军事学等领域的广泛应用逐渐被国内外学者所重视。近年来，因河豚鱼中毒的事件屡屡发生，所以人们对河豚毒素的快速检测方法做了很深入的研究。其中，免疫检测技术已经趋于成熟，且可成为方便、实用的检测手段。本研究以抗河豚毒素单克隆抗体为基础建立直接竞争ELISA法和间接竞争TRFIA法，同时优化反应条件，为研制河豚毒素快速检测试剂盒打下坚实的基础。 选择匙孔型血蓝蛋白(Keyholelimpethemocyanin，KLH)及卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)做为蛋白质载体，通过曼尼希法将之与半抗原河豚毒素偶联成为完全抗原KLH-TTX和OVA-TTX。用KLH-TTX免疫6～8周龄Balb/c雌性小鼠，制备抗TTX单克隆抗体。将OVA-TTX作为检测抗原，用于河豚毒素的检测模式中。 采用辛酸—硫酸铵沉淀法，对本实验室已制备出的腹水中的单克隆抗体进行纯化，从而获得高特异性的抗河豚毒素单克隆抗体。采用改良过碘酸钠方法制备酶标抗原和酶标单抗，并测得其酶标记率分别为40.8％和50％。 基于抗TTX河豚毒素单克隆抗体建立直接竞争ELISA(酶标抗原)方法检测河豚毒素。以抗TTX单克隆抗体包被酶标板，优化反应条件。结果表明反应温度对剂量—效应曲线有显著影响，37℃下检测所得的IC50值随着竞争反应时间的延长而增大，室温下检测所得的IC50值较为一致，其曲线性能更为稳定。此外单抗包被方法的研究中发现微波包被法可以提高dcELISA检测方法的灵敏度。建立的河豚毒素直接竞争ELISA(酶标抗原)检测法工作条件为：抗TTX单克隆抗体的包被浓度为4.94μg/mL，抗体包被方法为微波最小火力3min包板，酶标抗原的工作浓度为4.08μg/mL，酶标抗原的最佳稀释液为PBST+1％BSA，竞争反应时间为30min，反应温度为室温(20～25℃)，反应一步完成。建立的标准曲线IC50值约为21.4ng/mL，检测下限为1.1ng/mL，定量检测范围为3.3～137ng/mL，组内平均变异系数为6.25％，组间平均变异系数为7.32％。TTX的药物添加回收率为65％～93.2％。 基于抗TTX河豚毒素单克隆抗体建立直接竞争ELISA(酶标单抗)方法检测河豚毒素。以OVA-TTX包被酶标板，优化反应条件。结果表明37℃下检测所得的IC50值随着竞争反应时间的延长而增大，而室温下检测所得的IC50值较为一致，其曲线性能更为稳定。建立的河豚毒素直接竞争ELISA(酶标抗原)检测法工作条件为：OVA-TTX的包被浓度为4μg/mL，抗原最佳包被方法为37℃2h包板，酶标单抗的工作浓度为1.55μg/mL，酶标抗原的最佳稀释液是PBST+1％BSA，竞争反应时间为30min，反应温度为室温(20～25℃)，反应一步完成。该方法测得的IC50值约为25.5ng/mL，检测下限为0.8ng/mL，定量检测范围为2.9～222ng/mL，组内平均变异系数为9.09％，组间平均变异系数为9.34％。TTX的药物添加回收率为65.06％～100.2％。 在建立了河豚毒素直接竞争ELISA法的同时，对于抗原和抗体包板的稳定性以及酶标抗原和酶标单抗的稳定性进行了定期测定。结果表明：抗体包被的酶标板能在2～8℃下放置3个月；抗原包被的酶标板能在2～8℃下放置6个月左右；酶标抗原加1％BSA或等量甘油在4℃条件下可放置3个月，在—20℃条件下可放置4个月；酶标单抗在4℃或—20℃条件下，加1％BSA或等量甘油可放置3个月。 基于抗TTX单克隆抗体建立间接竞争时间分辨荧光免疫分析法(icTRFIA)检测河豚毒素。将羊抗小鼠二抗与Eu3+—N2—[β—异氰酸—苄基]—二乙烯三胺四乙酸(Eu3+—DTTA)偶联制备Eu3+标记羊抗小鼠二抗，然后通过SephadexG—25层析柱进行纯化。以OVA-TTX包被酶标板，优化包被浓度、竞争反应温度以及时间等因素。结果发现Eu3+标二抗对温度较为敏感，37℃下检测所得的IC50值随着竞争反应时间的延长而增大，而室温下的检测曲线性能较为稳定。建立的间接竞争时间分辨荧光免疫分析法的工作条件初步确定为：OVA-TTX的包被浓度为4μg/mL，Eu3+标二抗的工作浓度为2.4μg/mL，竞争反应时间为30min，反应温度为室温(20～25℃)。该法测得的IC50值约为19.8ng/mL，检测下限为0.24ng/mL，定量检测范围为1.23～319.06ng/mL。