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血管抑制疗法是目前肿瘤治疗研究的一个热点。1997年发现的内皮抑素因其抑制血管生成作用强而备受关注,内皮抑素重组蛋白在动物实验及临床试验中已显示出明显的抑瘤作用。但内皮抑素蛋白制剂存在时效短、需反复追加,并且可引起全身性副作用等不足,使其在临床的应用受到限制。为解决这一矛盾,本实验构建携带小鼠内皮抑素(mouse Endostatin,mES)基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-mES),在体外证明其转染效率、安全性及其血管抑制活性的基础上,研究Ad-mES对小鼠Lewis肺癌生长、转移的抑制及其与化疗的协同作用。目前国内尚无文献报道,本实验从以下三部分进行研究:第一部分 携带内皮抑素基因的增殖缺陷型重组腺病毒载体(Ad-mES)的构建及其制备目的 构建携带小鼠内皮抑素基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-mES),并进行体外安全性检测。方法 选择mES基因为治疗基因,以腺病毒作为基因转移工具,将其亚克隆至穿梭质粒中构建成转移质粒pCA13-mES,再通过阳离子脂质体法,与腺病毒基因组骨架质粒pBHGE3共转染293细胞,在293细胞内进行两质粒同源重组,构建成具有感染活力的复制缺陷型腺病毒Ad-mES。将酶切鉴定正确的病毒在293细胞内进一步扩增,通过氯化铯密度梯度离心法纯化和50%组织培养感染剂量法(TCID50)进行滴度测定,并通过感染Hela细胞对其安全性进行评价。结果 成功将mES基因插入腺病毒载体,扩增纯化后的重组腺病毒滴度高达1010pfu/ml;将该载体转染Hela(宫颈癌)细胞后,观察7天,细胞的形态及增殖均表现正常,未见细胞病理效应(CPE)。结论 我们所制备的重组腺病毒Ad-mES滴度高、纯度好、毒性低。第二部分 Ad-mES体外转染小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞及其转染上清对血管内皮细胞增殖的抑制作用目的 体外证明腺病毒载体的转染效率、安全性及其对血管内皮细胞的抑制活性,为下一步的体内研究奠定基础。方法 以携带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的重组腺病毒(Ad-GFP)转染LLC细胞,荧光显微镜下观察呈现绿色荧光细胞比例(即转染效<WP=6>率),并观察细胞的形态变化与增殖情况;分别以0.01、0.1、1、10、100 共5个不同感染复数(MOI)的Ad-mES转染LLC,及以100MOI的Ad-mES转染LLC,分不同时间点(24h、48h、72h、96h)收集转染上清。采用免疫组化法及Western印迹法,检测Ad-mES转染48h后mES蛋白的表达情况;应用ELISA法,分别检测其转染24h、48h、72h、96h后培养上清中的mES分泌水平;采用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)分析法,测定不同MOI值Ad-mES的转染上清对人脐静脉内皮细胞(ECV304)的增殖抑制作用。 结果 以100MOI的Ad-GFP转染LLC后,第2天表现出散在的荧光,至第4天呈现绿色荧光的细胞达80%以上,细胞增殖良好且形态未见明显改变;Ad-mES转染LLC 48h后,免疫组化显示:在Ad-mES转染组的LLC细胞浆内,可见棕黄色的mES阳性表达颗粒;Western印迹法结果显示:转染48h后的培养上清可表达位于20kDa的mES阳性条带,而未转染对照组呈阴性;ELISA测定结果显示:转染后的细胞培养上清中有mES分泌,其水平明显高于对照组 (p<0.01),并且其表达水平在一定范围内与MOI高低呈正相关;在可观察的时间区域内,mES的分泌可持续至转染后的96h;MTT结果表明:随转染Ad-mES MOI值的增高,对基础条件下及经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激的ECV304的增殖抑制作用呈递增趋势(与对照组相比p<0.001),并且对bFGF刺激的内皮细胞的抑制作用更为显著(与基础条件下相比p<0.05)。结论 我们构建的Ad-mES,能高效转染培养的LLC,转染效率可达80%以上;转染后,LLC能够表达、分泌mES,表达水平具有转染浓度依赖性;表达分泌于培养上清中的mES对血管内皮细胞(尤其是bFGF刺激)具有明显的增殖抑制作用。第三部分 Ad-mES对小鼠Lewis肺癌的抑制及其与环磷酰胺联合的协同作用目的 通过以Ad-mES治疗小鼠Lewis肺癌模型,观察其抑制血管生长、减少肿瘤血流灌注,进而抑制肿瘤生长、转移,并通过联合使用环磷酰胺,进一步探讨基因治疗与化疗的协同作用。方法 皮下注射LLC细胞(106/100μl),复制小鼠Lewis肺癌模型。成瘤后随机分4组进行实验:0组为0.9%生理盐水对照组;1组为单纯环磷酰胺化疗组;2组为单纯Ad-mES基因治疗组;3组为Ad-mES联合环磷酰胺治疗组。化疗组以环磷酰胺150mg/kg/次,分别于治疗第1、3、5天皮下注射,21天为一个周期,共给药3次,总量为450mg/kg/21day,治疗一个周期;基因治疗组予以一次性瘤内多点注射Ad-mES病毒纯化液100μl(滴度为6×1010pfu/ml);联合治疗组的Ad-mES及环磷酰胺用法用量同前;对照组注射0.9%生理盐水100μl,用法同环磷酰胺。用药后,每天观察不良反<WP=7>应,每3天测量肿瘤体积,计算抑瘤率;分别于治疗的第1、5、21天留取血清,ELISA法测定mES与VEGF水平;于接种肿瘤细胞第30天(即治疗第21天),处死小鼠(每组随机处死5只,余观察生存时间),剥离皮下肿瘤及肺,一份中性福尔马林固定,另一份迅速液氮冻存。病理学检测肿瘤坏死率、肺部转移灶,免疫组化检测mES表达、肿瘤微血管密度(MVD)以及Western印迹法检测mES表达;未处死的小鼠任其自然死亡,记录生存时间。结果 1.成功复制了小鼠Lewis肺癌模型:肿瘤细胞接种后第9天,可见直径约6~9mm的皮下肿瘤结节,成瘤率100%。2.目的基因成功导入瘤体并