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目的应用体外培养人正常皮肤(normal skin, NS)及瘢痕疙瘩(keloid)成纤维细胞模型,观察检测瘢痕疙瘩和正常皮肤组织及其细胞中4种线粒体凋亡途径相关蛋白表达。探讨线粒体凋亡途径在瘢痕疙瘩组织及成纤维细胞中的生物学作用,为瘢痕疙瘩形成机制以及相关治疗药物的研发提供实验依据。方法收集人体瘢痕疙瘩以及正常皮肤组织,低温条件下保存,组织切片用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(Terminal dexynucleotidyl Transferase(TdT)-mediated dUTP Nick-End Labeling TUNEL)法检测细胞凋亡；免疫组织化学检测细胞色素C (Cytochrome C, Cyt-C)的表达。应用组织块法原代培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast, KFB)及正常皮肤成纤维细胞(normal skin fibroblast, NSFB),在光镜下进行形态学观察；采用western blot检测Caspase-3. Caspase-9及Bcl-2; TUNEL法检测细胞凋亡以及罗丹明123(Rhodamine123, Rh123)染色检测线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPT’P)开放程度。结果1.成纤维细胞形态学观察在倒置显微镜下观察瘢痕疙瘩及正常皮肤标本各5例原代培养成纤维细胞形态变化,瘢痕疙瘩在接种后第7天有梭型细胞爬出,而正常皮肤在接种12天后才有细胞游离生长,细胞的生长排列多呈放射状、编织状、漩涡状走行。细胞体呈梭型或者不规则三角形,两者无明显差异,但正常皮肤成纤维细胞排列规律,呈平行极性,而瘢痕疙瘩成纤维细胞排列紊乱,极性消失,有明显交叉重叠现象。2. TUNEL染色分析结果表明,瘢痕疙瘩组(5.4±1.14) TUNEL染色阳性细胞较正常皮肤组TUNEL染色阳性细胞数(15.20±1.09)减少(t=13.86,P<0.01)3.Western blot检测凋亡相关蛋白瘢痕疙瘩组(0.79±0.08)较正常皮肤组(1.15±0.09)相比,Caspase3表达降低(t=6.45,P<0.01)。瘢痕疙瘩组(0.46±0.05)的Caspase9蛋白表达量相比正常皮肤组(0.57±0.08)减少(t=2.55,P<0.05),且正常组存在切割Caspase9的表达,瘢痕疙瘩组无此表达。Bcl-2蛋白表达量瘢痕组(0.72±0.03)明显高于正常组(0.49±0.05)(t=-8.663，P<0.01)。4.细胞色素C免疫组织化学染色光镜下瘢痕疙瘩组细胞色素C于皮肤表皮基底层周围呈弱阳性表达,真皮层成纤维细胞为淡蓝色,无明显表达。光镜下正常皮肤组细胞色素C阳性表达细胞数较多,染色较深,于表皮基底层及真皮的毛囊及血管周围多见。光镜下瘢痕疙瘩组综合评分(1.80±0.37)明显低于正常皮肤组(3.60±0.89)(t--4.18,,P<0.01)。5.罗丹明123免疫荧光瘢痕疙瘩与正常皮肤相比,瘢痕疙瘩组(0.01±0.01)罗丹明123免疫荧光强度低于正常皮肤组(0.04±0.01)(t=5.46,P<0.01),线粒体通透性转换孔开放程度低于正常组。结论1.在体外原代培养成纤维细胞体系中,Bcl-2在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达较正常皮肤明显增多,Caspase-9、Caspase-3在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达较正常皮肤明显减少,MPTP开放程度较正常皮肤减少,说明Bcl-2抑制MPTP开放,进而影响线粒体途径传递凋亡信号。Caspase-9、Caspase-3作为Caspase级联反应的终极环节,其蛋白表达水平降低,直接抑制细胞凋亡。2.瘢痕疙瘩在组织水平中TUNEL阳性细胞数均较正常皮肤组减少,提示线粒体凋亡途径信号失衡或传递受阻,可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞的过度增殖以及胶原大量沉积的核心因素之一。3.Cyt-C作为线粒体凋亡途径的关键步骤,在瘢痕疙瘩组织水平免疫组织化学中,其阳性表达明显低于正常皮肤,提示线粒体凋亡途径在瘢痕疙瘩形成机制中发挥重要作用。