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多形性胶质母细胞瘤(GBM)是一类具有高侵袭特点的原发性脑肿瘤,肿瘤组织常常入侵周围正常组织,外科手段治疗效果不理想,术后常复发,患者预后差。神经胶质瘤的一个重要特征是表皮生长因子受体(EGFR)的基因扩增或重排,40-50%的胶质瘤细胞存在EGFR异常增高并伴随多种基因突变,其中最常见的突变形式是表皮生长因子突变体Ⅲ(EGFRvⅢ)。EGFRvⅢ是EGFR胞外区的框内缺失突变,即胞外部分2-7外显子801bp碱基的缺失,使外显子1和外显子8相连接,并且在其结合点部分新产生一个甘氨酸。与野生型EGFR相比,EGFRvⅢ缺失第6至273位氨基酸残基,即配体结合区。EGFRvⅢ是一种非配体依赖的可自身持续磷酸化的EGFR突变类型,其本身不能与配体结合,受体即可产生持续的转导信号。近年来研究发现,EGFRvⅢ可以通过促进细胞的增殖,侵袭和迁移,减低细胞的死亡来促进胶质瘤的发生发展。本课题组曾报道,EGFRvⅢ在U87人大脑胶质瘤细胞中的过表达能够促进细胞的迁移,但其作用机制尚未明确。这是我们研究的重点。EGFRvⅢ促进的胶质瘤细胞的侵袭与粘着斑激酶FAK Y397位点的酪氨酸磷酸化密切相关。FAK是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶,是细胞存活,增殖,迁移以及侵袭等生物行为的重要调节分子,在胶质瘤细胞的侵袭中发挥重要作用。对FAK活性的抑制可以诱导细胞的死亡,抑制细胞的迁移。本课题组也曾报道,在U87AEGFR胶质瘤细胞中FAK与细胞的生长和侵袭密切相关。胞外信号调节激酶(ERK1/2)是FAK信号通路关键的下游分子之一。作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要的信号分子,ERK被激活后,可以进入细胞核,调控基因的转录,影响细胞的侵袭。人脑恶性胶质瘤典型的病理生理特征之一是由激活的ERK1/2的表达和分泌引起的肿瘤浸润。EGFRvⅢ表达的胶质溜细胞中ERK通路可以持续性激活,临床应用的许多抗肿瘤药物也将ERK通路作为治疗的重要靶点。本课题将主要探索EGFRvⅢ通过FAK及其下游分子通路调节胶质瘤细胞迁移增强的分子机制。在本论文中,我们将GFP质粒,突变型ΔEGFR以及野生型EGFR质粒转入人大脑胶质瘤U87细胞株中构建的稳转细胞株分别命名为U87GFP, U87AEGFR以及U87EGFR细胞。我们发现(1)与U87GFP细胞相比,U87AEGFR细胞的FAK Y397位点和EGFR Y1068位点的磷酸化水平均有上升；(2)应用RNA干扰技术,使FAK在mRNA水平和蛋白表达均下调的同时,U87ΔEGFR细胞的迁移也受到显著抑制。这与U87EGFR阳性对照组结果一致。我们提出了这样一种假设,EGFRvⅢ与FAK结合形成复合物,进而导致FAK Y397以及EGFR Y1068位点的磷酸化活性增强,引起FAK的活化及其下游分子参与了EGFRvⅢ促进的细胞迁移。我们用免疫共沉淀和激光共聚焦的方法证明了EGFRvⅢ与FAK形成复合物,为了进一步探索复合物的形成是如何影响下游信号分子的,我们针对FAK进行RNA干扰并检测其下游信号分子ERK, AKT, JNK的表达及其磷酸化水平的变化。结果显示,FAK表达下调的同时ERK1/2磷酸化水平也发生大幅下调。与此同时,我们做了体外细胞迁移实验来进一步明确ERK1/2的活性在调节胶质瘤细胞迁移中的作用,用U0126(MEK1/2抑制剂)作用于U87AEGFR细胞株1小时,结果表明U87ΔEGFR胶质瘤细胞迁移的68%受到明显的抑制。这证明ERK1/2参与了EGFRvIII-FAK促进的胶质瘤细胞迁移信号转导通路。综上所述,我们发现EGFRvⅢ与FAK形成复合物,进而促进FAK Y397以及EGFR Y1068位点的磷酸化活性增强,EGFRvIII-FAK的复合物又通过调节下游信号分子ERK1/2的活性来促进胶质瘤细胞的迁移,这些因素共同作用促进U87AEGFR细胞的迁移,这可能是EGFRvⅢ促进胶质瘤细胞迁移的分子机制之一。于是,在胶质瘤的临床治疗中可以将EGFRvⅢ作为治疗靶点之一,通过抑制其表达或者下调其酪氨酸磷酸化而达到治疗目的,具有一定的治疗意义。