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研究背景:RUNX1(Runt related transcription factor 1)是调控永久性造血系统发生的关键转录因子,RUNX1相关的基因突变和染色体易位在包括白血病在内的各种血液系统恶性肿瘤中十分常见。近些年来,随着测序技术的不断进步,越来越多的证据表明,RUNX1在乳腺癌中也发挥着重要作用。2012年的两项独立的大型全基因组测序研究,均报道了 RUNX1是乳腺癌中最常见的突变基因之一。随后的研究证明,在乳腺发育的不同时期,RUNX1的表达水平具有明显的时空特异性,同时,RUNX1还可以调控乳腺上皮细胞的谱系分化和干/组细胞潜能。然而目前,针对RUNX1在乳腺癌中的作用的研究并未得到一个定性的结论。现有的证据表明,RUNX1似乎在不同类型的乳腺癌中,可以分别起到抑制和促进肿瘤进展的作用。RUNX1表达的精细调控是RUNX1正常发挥调控功能的基础。在转录水平,RUNX1可以由两个启动子转录,包括一个远端启动子P1和一个近端启动子P2。激活不同的启动子可以转录生成具有不同氨基端的RUNX1蛋白亚型,且两个启动子的转录激活具有组织选择性和时空特异性。这种两个启动子参与转录调控的模式,保证了任一时刻“适量”的RUNX1被转录出来。然而,RUNX1启动子选择性激活的调控机制目前尚不明确。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是基因表达调控的重要因子,它可以影响基因的转录、修饰、翻译等各个阶段,参与了包括胚胎发育、干细胞维持、细胞分化和凋亡、物质代谢、感染以及免疫应答等几乎所有生理和病理过程的调控。我们实验室在前期工作中发现并成功鉴定了一条位于RUNX1基因座,和 RUNX1 基因重叠的长链非编码 RNA RUNXOR(RUNX1 overlapping long noncoding RNA,RUNXOR),并且证实RUNXOR可以结合RUNX1基因的启动子和基因调节序列,提示RUNXOR可能会影响RUNX1基因,从而发挥重要的调控作用。然而,由于RUNXOR长达260kb,无法通过常规的过表达技术对其进行功能研究,至今,关于RUNXOR的很多问题我们尚不知晓。例如,RUNXOR是否可以调节RUNX1,如果可以,又是以何种机制影响RUNX1的;更进一步,在RUNX1突变和表达异常频发的乳腺癌和白血病等恶性肿瘤中,RUNXOR是否参与了 RUNX1的异常表达调控;而这一过程又能否作为潜在的靶点用于肿瘤的靶向治疗,这些我们都不得而知。深入探究这些问题可以帮助我们更进一步了解RUNX1的调控机制,认识RUNX1在肿瘤中异常表达的原因,从而为临床中RUNX1表达异常的乳腺癌患者提供治疗的新思路。研究目的:探究乳腺癌细胞中长链非编码RNA RUNXOR是否可以调控RUNX1及其可能机制,以及在乳腺癌中激活RUNXOR-RUNX1轴对乳腺癌细胞恶性表型的影响,为RUNX1异常的乳腺癌患者的临床治疗探寻新的治疗靶点。研究方法:首先通过相关性分析,比较十二种不同组织学来源的细胞系中lncRNA RUNXOR和RUNX1 mRNA在表达水平上的相关关系。再以MCF-7细胞为对象,借助CRISPR-Cas9技术,在RUNXOR启动子处插入一个强启动子pCMV,构建RUNXOR原位激活模型(endogenous gene in situ activation),实现内源性的RUNXOR原位高表达。利用该模型进一步探究RUNXOR对RUNX1表达以及启动子选择性激活的调控作用。机制上,借助染色质构象捕获技术,DNA甲基化分析,RNA结合蛋白免疫共沉淀技术,以及组蛋白染色质免疫共沉淀技术,探究lncRNA RUNXOR是否可以通过表观遗传学修饰来参与RUNX1的调控。最后,利用该细胞模型,检测激活RUNXOR-RUNX1轴后,乳腺癌细胞在增殖速度,凋亡,以及迁移能力等方面的变化,探究RUNXOR-RUNX1轴在乳腺癌细胞中的作用。研究结果:1.通过对十二种不同组织学来源的细胞系中lncRNA RUNXOR和RUNX1 mRNA的水平进行检测,发现lncRNA RUNXOR和RUNX1在表达上存在显著的相关性(r=0.8790,p<0.0001)。对RUNX1总体水平按照不同启动子来源进行区分后,发现RUNXOR和由远端启动子P1转录的RUNX1 mRNA存在显著相关关系(r=0.7960,p<0.0001),而和近端启动子P2转录的RUNX1 mRNA未见明显相关性(r=-0.3774,p=0.1226)。证明RUNXOR可能参与了 RUNX1启动子选择性激活的调控。2.成功构建RUNXOR原位激活的MCF-7细胞模型,发现RUNXOR原位过表达后,RUNX1总体水平显著升高。进一步研究发现,RUNXOR激活了 RUNX1的远端启动子P1,且由其转录的RUNX1转录本显著增高(p<0.0001),而对RUNX1近端启动子没有影响。Western blot证明远端启动子激活后,RUNX1在蛋白水平也显著增高,以RUNX1c亚型为主。3.RUNXOR可以通过表观遗传学修饰,介导RUNX1远端启动子P1的选择性激活。具体来讲,RUNXOR可以诱导RUNX1基因座的染色质构象发生改变,形成以P1/RE2为主的染色质环结构;还可以诱导RUNX1远端启动子P1去甲基化,激活其转录活性;同时,RUNXOR还能够影响RUNX1远端启动子的组蛋白甲基化修饰,增加具有转录激活作用的H3K4me3标志的数量,使P1附近的染色质呈现更为开放的状态,便于转录的激活。4.RUNXOR-RUNX1轴在MCF-7细胞中的激活,可以显著抑制乳腺癌细胞的迁移能力,延长G0/G1期,诱导细胞发生G1/S期阻滞。而细胞的增殖速度,凋亡等没有受到影响。结论:1.LncRNA RUNXOR可以通过表观遗传学修饰,特异性激活RUNX1远端启动子P1的转录活性,参与到RUNX1基因启动子选择性激活的调控中。2.RUNXOR-RUNX1轴在MCF-7乳腺癌细胞中的激活,可以抑制细胞的迁移能力,诱导细胞发生G1/S期阻滞,起到抑制肿瘤进展的作用。3.我们发明的Cas9介导的lncRNA原位激活技术,克服了常规的基因过表达技术的弊端,可以实现目的基因在原位的高表达。该技术可以广泛地应用于基础科研和转化医学之中。