【摘 要】
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第一部分:Moesin在多发性骨髓瘤细胞中的表达和生物学功能目的:检测膜结构伸展刺突蛋白（Moesin,MSN）在多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）细胞中的表达情况以及体外研究MSN对多发性骨髓瘤的作用。方法:（1）利用GEO数据库分析MSN在MM发病中各个阶段的表达情况以及MSN的表达水平对多发性骨髓瘤患者生存率的影响。（2）通过qPCR和Western blot方法检测MM
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第一部分:Moesin在多发性骨髓瘤细胞中的表达和生物学功能目的:检测膜结构伸展刺突蛋白（Moesin,MSN）在多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）细胞中的表达情况以及体外研究MSN对多发性骨髓瘤的作用。方法:（1）利用GEO数据库分析MSN在MM发病中各个阶段的表达情况以及MSN的表达水平对多发性骨髓瘤患者生存率的影响。（2）通过qPCR和Western blot方法检测MM细胞株中MSN mRNA和蛋白的表达情况。（3）设计并构建靶向人MSN基因的shRNA慢病毒载体,利用293T细胞包装慢病毒后感染MM.1R,NCI-H929和MM.1S细胞,通过CCK8和软琼脂克隆形成实验检测敲低MSN对MM细胞活力和细胞增殖的影响。（4）通过Annexin-V/7-AAD和Brdu联合DAPI染色流式分析敲低MSN对MM.1R,NCI-H929和MM.1S细胞凋亡和细胞周期的影响,同时通过Western blot进一步检测敲低MSN对MM.1R,NCI-H929和MM.1S细胞中相关凋亡蛋白表达水平的影响。（5）设计并构建过表达MSN的慢病毒载体,利用293T细胞包装慢病毒后感染在MM细胞中表达水平相对较低的RPMI-8226细胞,通过CCK8和软琼脂克隆形成实验检测过表达MSN对RPMI-8226细胞活力和细胞增殖的影响。结果:（1）通过GEO数据库发现,随着疾病进展,MM患者MSN的表达水平与正常人的相比明显升高;高水平的MSN提示MM患者生存率差;骨髓瘤的高风险亚组MSN mRNA表达水平与低风险亚组的相比明显升高。（2）qPCR和Western blot检测发现五种MM细胞株中MSN的mRNA和蛋白均有表达。其中:MSN在MM.1S,MM.1R,U266和NCI-H929细胞表达水平相对较高,在RPMI-8226细胞表达水平相对较低。（3）与对照组相比,敲低MSN能明显抑制MM.1R,NCI-H929和MM.1S细胞的活力和克隆形成能力。（4）与对照组相比,敲低MSN能明显诱导MM.1R,NCI-H929和MM.1S的凋亡,主要通过内源和外源性凋亡途径介导;同时也能阻滞MM.1R,NCI-H929和MM.1S的细胞周期。（5）与对照组相比,过表达MSN能明显促进RPMI-8226细胞的增殖和克隆形成能力。结论:（1）MSN在多发性骨髓瘤患者中呈现高表达并与低生存率相关。（2）敲低MSN可抑制MM细胞的活力和细胞增殖能力,并且诱导肿瘤细胞凋亡,提示MSN对MM细胞的生存、生长具有重要作用,可能作为治疗多发性骨髓瘤的潜在靶点。第二部分:Moesin促进多发性骨髓瘤效应的分子机制研究目的:体外探究MSN促进MM效应的分子机制方法:（1）利用293T细胞包装过表达MSN的慢病毒后感染NCI-H929细胞,得到稳定过表达MSN的细胞系NCI-H929-MSN。利用免疫沉淀-质谱（IP-MS）技术寻找MSN的相互作用蛋白。（2）通过CO-IP实验验证MSN与ADAR1/IFI16是否相互作用。（3）提取胞浆胞核蛋白,通过Western blot检测MSN和IFI16在五种MM细胞系中（MM.1R,NCI-H929,MM.1S,U266 和 RPMI-8226）的定位情况。（4）设计并构建靶向人IFI16基因的shRNA慢病毒载体,利用293T细胞包装慢病毒后感染MM.1R,NCI-H929和MM.1S细胞,通过CCK8实验检测敲低IFI16对MM细胞活力的影响。（5）通过 Annexin-V/7-AAD 染色流式分析敲低 IFI16 对 MM.1R,NCI-H929和MM.1S细胞凋亡的影响,同时通过Western blot进一步检测敲低IFI16对NCI-H929和MM.1S细胞相关凋亡蛋白的表达影响。结果:（1）在过表达MSN的NCI-H929细胞中,IP-MS发现有50多种蛋白与MSN结合,其中较多为胞核蛋白。（2）CO-IP结果显示MSN与ADAR1/IFI16相互作用。（3）在五种MM系中检测到MSN和IFI16在胞浆胞核内均有表达。（4）与对照组相比,敲低IFI16能明显抑制MM.1R,NCI-H929和MM.1S细胞的活力。（5）与对照组相比,敲低IFI16能明显诱导MM.1R,NCI-H929和MM.1S的凋亡。结论:（1）MSN与IFI16和ADAR1相互作用。（2）IFI16能调控MM细胞的活力和凋亡。
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