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铜绿假单胞菌是猪精液中普遍存在的优势菌种,通过损伤精子的质膜、顶体及线粒体超微结构等作用方式降低精子活力,影响母猪的受胎率及产仔数。目前,铜绿假单胞菌降低精子活力的具体作用机制尚未明确,尤其铜绿假单胞菌对精子能量代谢及蛋白翻译后修饰水平影响的相关报道甚少。因此,本研究以精子活力的降低为切入点,在评估铜绿假单胞菌对精子作用方式及精子形态学变化的基础上,主要针对精子能量代谢通路及蛋白翻译后修饰水平的变化,深入探究铜绿假单胞菌对精子ATP主要来源的糖酵解及线粒体氧化磷酸化代谢过程,蛋白磷酸化及酰化修饰水平的影响,以期为阐述铜绿假单胞菌影响猪精子活力及作用机制提供理论基础,为制定猪精液质量标准提供参考依据。本研究主要包括以下四个部分:1、本实验利用不同浓度的铜绿假单胞菌处理精子,分析铜绿假单胞菌对精子的具体作用方式。结果显示,随着铜绿假单胞菌浓度的增加,精子的活力显著降低(P<0.05),质膜、顶体完整性及线粒体膜电位显著降低(P<0.05);电镜结果发现精子的质膜、顶体及线粒体超微结构破坏严重,证实铜绿假单胞菌主要通过纳米管通道及释放OMVs等作用方式降低精子活力。2、精子活力的维持主要来源于糖酵解及线粒体氧化磷酸化能量代谢途径,同时与蛋白翻译后修饰水平具有密切联系。铜绿假单胞菌是否通过调控猪精子能量代谢及蛋白翻译后修饰水平降低精子活力?本研究结果显示,随着铜绿假单胞菌浓度的增加,精子糖酵解过程中关键酶GAPDH活性,电子传递链中NADH含量及细胞内ATP水平均显著降低(P<0.05);同时增强蛋白脱乙酰化、脱琥珀酰化修饰水平,c AMP水平的降低从而促进了蛋白丝/苏氨酸脱磷酸化、酪氨酸脱磷酸化水平,遵循c AMP-PKA信号通路降低猪精子活力。3、本研究首次发现铜绿假单胞菌OMVs在降低猪精子活力方面具有重要作用,为进一步探究OMVs是如何影响精子能量代谢及蛋白翻译后修饰水平,实验利用不同浓度的OMVs处理精子。结果显示,随着OMVs浓度的增加,精子糖酵解过程中关键酶GAPDH活性降低,但未发生显著性差异(P>0.05),电子传递链中NADH含量及细胞内ATP水平均显著降低(P<0.05);同时提高蛋白脱乙酰化、脱琥珀酰化修饰水平,但未发生显著性差异(P>0.05),c AMP水平的降低从而促进蛋白丝/苏氨酸脱磷酸化、酪氨酸脱磷酸化水平,遵循c AMP-PKA信号通路降低猪精子活力。结果提示,OMVs作为铜绿假单胞菌的主要作用方式,但与铜绿假单胞菌影响精子活力及作用机制有所差异,主要通过影响NADH及ATP水平,遵循c AMP-PKA信号通路影响精子蛋白磷酸化修饰降低精子活力。4、为筛选OMVs中降低精子活力的特异性蛋白,利用质谱技术对OMVs蛋白种类及数量初步探究。OMVs共鉴定出152种特异性蛋白,候选蛋白包括氨肽酶(Pa AP)、外膜孔蛋白(Opr F,Opr E,Opr D,Opr H,Opr C)、鞭毛蛋白(Hap 2)及溶血素共调节蛋白(Hcp)等。KEGG通路富集分析结果表明主要涉及氨酰t RNA生物合成,精氨酸生物合成,β-内酰胺抗性,C5支链酸代谢及阳离子抗菌肽抗性等过程;GO功能富集分析结果表明差异表达基因与有机氮化合物代谢过程,胞质组分类别及绑定蛋白分子功能有关。综上所述,铜绿假单胞菌主要通过粘附精子形成纳米管通道及OMVs等作用模式,破坏精子形态结构,抑制精子糖酵解过程中关键酶GAPDH活性,降低线粒体氧化电子传递链中NADH含量及细胞内ATP水平;同时,促进蛋白脱乙酰化和脱琥珀酰化,降低c AMP水平,从而促进蛋白丝/苏氨酸脱磷酸化、酪氨酸脱磷酸化水平,磷酸化变化遵循c AMP-PKA信号通路进而降低猪精子活力。