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诺卡氏菌(Nocardia cyriacigeorgica)是一种革兰氏阳性环境致病菌,能引人和奶牛的多种诺卡氏菌病。诺卡氏菌性奶牛乳房炎是奶牛诺卡氏菌病中最重要的一种类型,给奶牛养殖业造成了一定的经济损失。多种诺卡氏菌能引起奶牛乳房炎的发生,但是关于奶牛乳房炎性N.cyriacigeorgica的研究较少。诺卡氏菌诱导奶牛乳房炎发生的相关致病机制尚不清楚。因此本研究通过传统的细菌鉴定方法和分子生物学方法对河北某牛场暴发的奶牛乳房炎进行了诺卡氏菌的分离和鉴定。同时,本研究通过建立诺卡氏菌感染小鼠乳腺和牛乳腺上皮细胞(MAC-T细胞系)模型,采用组织病理学、电子显微镜、流式细胞术、western blot和实时荧光定量PCR等技术,评估诺卡氏菌的致病性,探索诺卡氏菌引起奶牛乳房炎的致病机制。从87份乳房炎样品中分离到的12株诺卡氏菌均为N.cyriacigeorgica。该诺卡氏菌能在37℃和45℃生长,能分解乙酰胺,能产生过氧化物酶和硝酸盐还原酶。药物敏感性试验结果显示,诺卡氏菌分离株对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、环丙沙星、米诺环素、利福平和氨基糖苷类等药物表现多重耐药性;对阿米卡星、磺胺甲恶唑、头孢噻肟和亚胺培南敏感。这对于指导临床用药具有重要意义。小鼠乳房炎模型结果显示,诺卡氏菌乳腺内感染能引起小鼠乳腺的慢性炎症反应,伴随充血、水肿、炎性细胞浸润、淋巴组织增生和坏死。同时,小鼠出现采食量下降、被毛逆立和反应迟钝等临床症状。牛乳腺上皮细胞感染试验结果显示,诺卡氏菌菌丝能粘附和穿入细胞引起明显的细胞变形,线粒体肿胀变性,染色质凝集,核溶解,细胞膜破裂,最后细胞发生坏死。DNA ladder和AnnexinV/PI染色结果显示,N.cyriacigeorgica能诱导乳腺上皮细胞发生凋亡;进一步分析发现细胞线粒体膜电位降低,线粒体细胞色素c释放量升高,Bcl-2mRNA表达量下降,BaxmRNA表达量上升,同时caspase-9和caspase-3的蛋白表达量升高。上述结果表明,N.cyriacigeorgica可以同时诱导细胞凋亡和坏死;线粒体-caspase信号通路参与诺卡氏菌诱导的牛乳腺上皮细胞凋亡。细胞炎性因子表达量检测结果显示,N.cyriacigeorgica能促进牛乳腺上皮细胞中多种促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12和IL-18)mRNA表达量的升高;同时伴随模式识别受体(TLR2 和 TLR4)和相关信号分子(NLRP3、ASC 和 caspase-1)mRNA 表达量升高。Western blot检测结果显示IκB-α呈降解趋势,磷酸化NF-κB-p65、NLRP3和caspase-1表达呈升高趋势。以上结果提示牛乳腺上皮细胞可能通过TLR2和TLR4识别诺卡氏菌,激活NF-κB信号通路,从而调控细胞炎性反应。NLRP3表达量的升高提示N.cyriacigeorgica也可能通过NLRP3炎性体激活caspase-1,促进IL-1β和IL-18产生,继而引发细胞焦亡。综上所述,诺卡氏菌的致病机制包括以下三点:(1)诺卡氏菌可粘附和侵入乳腺上皮细胞,引起细胞损伤;(2)诺卡氏菌可通过线粒体-caspase途径诱导乳腺上皮细胞发生凋亡;(3)诺卡氏菌感染诱导牛乳腺细胞中多种促炎性细胞因子的高表达。