ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)是一种重要的细胞质酶,催化细胞质中的柠檬酸生成草酰乙酸和乙酰辅酶A,它可能在植物的正常生长和某些次生代谢物的生物合成中起重要作用。柠檬酸含量是柑橘类果实品质的重要决定因素之一,因此,研究ACL在柑橘果实柠檬酸代谢中的作用有重要的意义。本实验首先以已报道的柑橘基因组为基础,挖掘ACL基因,然后以暗柳橙为研究材料,对柑橘中编码ACL的基因进行了研究;以暗柳橙、红暗柳橙以及6种常见的柑橘栽培品种为材料,研究了不同发育时期柑橘果实汁胞中的柠檬酸含量变化,ACL活性及其基因表达变化;以温州蜜柑为材料,研究ABA处理,覆膜处理和羟基柠檬酸处理分别对柑橘果实中的柠檬酸含量,ACL活性及其基因表达的影响,从中探讨柑橘ACL的特性和其在柠檬酸代谢中的作用。实验主要的研究结果如下:1.ACL基因的挖掘和分子特征分析研究发现,在柑橘基因组数据库中编码Cit ACL的基因有3个,将它们命名为Cit ACLα1、Cit ACLα2和Cit ACLβ1,其中Cit ACLα1和Cit ACLα2编码ACLα亚基,而Cit ACLβ1编码ACLβ亚基。Cit ACLα1和Cit ACLα2蛋白质中有82.5%相同的氨基酸。分析3个基因的结构显示,Cit ACLα1和Cit ACLα2基因中均存在12个外显子和11个内含子结构,Cit ACLβ1中存在16个外显子和15个内含子。将Cit ACL氨基酸序列与人类的ACL氨基酸序列进行比对,发现Cit ACLα亚基和Cit ACLβ亚基之间有60个左右的氨基酸缺失。2.ACL的组织表达特异性分析研究Cit ACLα1、Cit ACLα2和Cit ACLβ1基因在柑橘不同组织结构中的表达发现,Cit ACLα1基因主要在花中表达,而其在果实汁胞中表达量最低。Cit ACLα2基因主要在茎和根中表达;在果实汁胞、叶片和花三个组织中表达量相似。Cit ACLβ1基因的表达与Cit ACLα1基因相似,其主要在花中表达,在叶片中和果实汁胞中表达量相似。3.暗柳橙和红暗柳橙成熟过程中柠檬酸测定与编码ACL的基因表达分析对4个不同成熟期的暗柳橙和红暗柳橙的果实汁胞中的柠檬酸含量测定的结果显示,暗柳橙柠檬酸含量先升高,花后134d的果实汁胞中柠檬酸含量最高,随后其柠檬酸含量下降。红暗柳橙4个时期果实汁胞中柠檬酸含量均为零。对应的Cit ACLα1、Cit ACLα2和Cit ACLβ1基因表达的研究结果显示,暗柳橙的3个基因和红暗柳橙的Cit ACLβ1基因的表达模式均相似,即随着果实成熟,其表达量先降低再升高。而红暗柳橙的Cit ACLα1和Cit ACLα2基因的表达模式相似,是随着果实成熟,其表达量先升高再降低。暗柳橙中随着果实成熟,柠檬酸的含量和3个基因的表达趋势相反,说明ACL确实有可能在暗柳橙的柠檬酸代谢中起作用。4.不同品种的柑橘的柠檬酸测定,ACL活性测定与基因表达分析分别测定了不同柑橘果实两个不同时期(T1和T2)柠檬酸、ACL活性和基因表达,结果发现纽荷尔、温州蜜柑、椪柑和伊予柑果实汁胞中的柠檬酸含量随着果实成熟显著降低,纽荷尔和温州蜜柑果实汁胞中编码Cit ACL的基因表达升高,而椪柑和伊予柑中其表达降低;HB柚果实汁胞中的柠檬酸含量在T2时期显著高于T1时期,无酸柚的柠檬酸含量则均为零,而它们的果实汁胞中编码Cit ACL的基因表达升高。对应的ACL活性测定结果显示,纽荷尔、温州蜜柑、HB柚和无酸柚果实汁胞中的ACL活性均是随着果实成熟显著升高;而椪柑和伊予柑则是显著降低。这些结果表明,ACL对果实成熟过程中柠檬酸代谢的作用可能与柑橘品种有关。5.不同处理的温州蜜柑的柠檬酸测定,ACL活性测定与基因表达分析覆膜和ABA注射均使温州蜜柑果实中的柠檬酸含量显著升高,而使ACL活性显著降低。覆膜处理使果实汁胞中编码Cit ACL的3个基因的表达量均显著降低,而ABA处理只导致Cit ACLβ1的表达量显著降低。说明在覆膜和ABA注射处理的条件下,编码Cit ACL的基因表达的降低可能是导致果实汁胞柠檬酸含量升高的重要原因。羟基柠檬酸是ACL的抑制剂,注射羟基柠檬酸使温州蜜柑果实中的柠檬酸含量显著升高,而使ACL活性显著降低。结果表明,ACL在一定程度上对果实的柠檬酸代谢起作用。