论文部分内容阅读
【背景】
黄连素(Berberine，BBR)是一种从中草药黄连或其他植物中提取的异喹啉生物碱，最近研究发现其具有抗炎、抗肿瘤以及免疫调节作用。其衍生物可通过激活AMPK信号轴、抑制STAT1磷酸化从而增强NK细胞对肺癌细胞A549的杀伤作用。基于NK细胞的免疫治疗，如基因修饰NK细胞过继免疫治疗、细胞因子修饰免疫治疗尤其与化疗药物联合治疗，是一种治疗中晚期肝癌的有效手段。前期研究发现黄连素能联合正常健康人或肝癌患者外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cells, PBMCs)抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡，但其机制并不清楚。
【目的】
探讨BBR促进PBMCs杀伤肝癌细胞的作用及其机制。
【研究方法】
1.采用人外周血单个核细胞提取试剂盒提取正常健康人和肝癌患者PBMCs，加入IL-2后于培养箱正常观察并培养一定时间；
2.加入BBR(60μmol/L、80μmol/L)与PBMCs共同作用肝癌细胞SMMC-7721和Hep3B一定时间，MTS和EdU检测肝癌细胞的增殖情况；
3.加入BBR(60μmol/L、80μmol/L)与PBMCs共同作用肝癌细胞SMMC-7721和Hep3B一定时间,TUNEL试剂盒检测肝癌细胞凋亡；
4.流式细胞学技术检测与肝癌细胞和BBR共培养后一定时间后，外周血PBMCs的细胞表面抗原表达，观察细胞群变化情况；
5.建立PBMCs与肝癌细胞共培养的肿瘤免疫微环境，加入不同浓度的BBR，利用qPCR和Westernblot技术检测肿瘤细胞PD-L1的基因和蛋白水平表达的变化情况；
6.用正常肝细胞WRL-68和L02验证BBR与PBMCs的联合作用效果。
【结果】
1.BBR与正常健康人或肝癌患者PBMCs共同作用肝癌细胞不同时间点后，MTS检测结果均发现联合作用的肝癌细胞增殖明显低于各自单独作用肝癌细胞组，且联合作用具有一定时间依赖关系；
2.在BBR与正常健康人PBMCs共同作用肝癌细胞36h后，EdU检测肝癌细胞S期的细胞比例在联合作用后明显减少，并在肝癌患者外周血中也发现类似的联合效果；
3.利用TUNEL试剂盒检测BBR与正常健康人PBMCs共同作用肝癌细胞36h后，发现联合作用下的肝癌细胞凋亡显著增强。而单独肝癌患者PBMCs作用肝癌细胞的凋亡并不明显，在联合BBR后与单独处理组比凋亡明显增多。同时，凋亡蛋白PARP的表达也能观察到类似的效果；
4.流式细胞学技术检测正常健康人血和肝癌患者PBMCs在与肝癌细胞和BBR共培养36h后细胞表面抗原，正常血和肝癌血均可发现以CD3-CD56+和CD3-CD16+为主的NK细胞群频数在BBR作用后显著增多，以CD3-CD16+细胞群较为显著，且在与肝癌细胞的共培养后同样可以观察到类似的效果；
5.PBMCs与SMMC-7721及Hep3B作用36h后，PD-L1的mRNA和蛋白水平均显著性的上升，但加入BBR不同浓度后均能观察到梯度的下降情况，以蛋白水平的下降较为显著；
6.正常肝癌细胞对BBR和PBMCs的作用均不敏感，BBR和PBMCs的联合作用具有肿瘤特异性。
【结论】
1.体外研究发现黄连素能促进正常健康人和肝癌患者PBMCs的抗肝癌效应。
2.黄连素能上调PBMCs中NK细胞频数。
3.PD-L1在黄连素促PBMCs抗肝癌作用中可能发挥重要作用。
黄连素(Berberine，BBR)是一种从中草药黄连或其他植物中提取的异喹啉生物碱，最近研究发现其具有抗炎、抗肿瘤以及免疫调节作用。其衍生物可通过激活AMPK信号轴、抑制STAT1磷酸化从而增强NK细胞对肺癌细胞A549的杀伤作用。基于NK细胞的免疫治疗，如基因修饰NK细胞过继免疫治疗、细胞因子修饰免疫治疗尤其与化疗药物联合治疗，是一种治疗中晚期肝癌的有效手段。前期研究发现黄连素能联合正常健康人或肝癌患者外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cells, PBMCs)抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡，但其机制并不清楚。
【目的】
探讨BBR促进PBMCs杀伤肝癌细胞的作用及其机制。
【研究方法】
1.采用人外周血单个核细胞提取试剂盒提取正常健康人和肝癌患者PBMCs，加入IL-2后于培养箱正常观察并培养一定时间；
2.加入BBR(60μmol/L、80μmol/L)与PBMCs共同作用肝癌细胞SMMC-7721和Hep3B一定时间，MTS和EdU检测肝癌细胞的增殖情况；
3.加入BBR(60μmol/L、80μmol/L)与PBMCs共同作用肝癌细胞SMMC-7721和Hep3B一定时间,TUNEL试剂盒检测肝癌细胞凋亡；
4.流式细胞学技术检测与肝癌细胞和BBR共培养后一定时间后，外周血PBMCs的细胞表面抗原表达，观察细胞群变化情况；
5.建立PBMCs与肝癌细胞共培养的肿瘤免疫微环境，加入不同浓度的BBR，利用qPCR和Westernblot技术检测肿瘤细胞PD-L1的基因和蛋白水平表达的变化情况；
6.用正常肝细胞WRL-68和L02验证BBR与PBMCs的联合作用效果。
【结果】
1.BBR与正常健康人或肝癌患者PBMCs共同作用肝癌细胞不同时间点后，MTS检测结果均发现联合作用的肝癌细胞增殖明显低于各自单独作用肝癌细胞组，且联合作用具有一定时间依赖关系；
2.在BBR与正常健康人PBMCs共同作用肝癌细胞36h后，EdU检测肝癌细胞S期的细胞比例在联合作用后明显减少，并在肝癌患者外周血中也发现类似的联合效果；
3.利用TUNEL试剂盒检测BBR与正常健康人PBMCs共同作用肝癌细胞36h后，发现联合作用下的肝癌细胞凋亡显著增强。而单独肝癌患者PBMCs作用肝癌细胞的凋亡并不明显，在联合BBR后与单独处理组比凋亡明显增多。同时，凋亡蛋白PARP的表达也能观察到类似的效果；
4.流式细胞学技术检测正常健康人血和肝癌患者PBMCs在与肝癌细胞和BBR共培养36h后细胞表面抗原，正常血和肝癌血均可发现以CD3-CD56+和CD3-CD16+为主的NK细胞群频数在BBR作用后显著增多，以CD3-CD16+细胞群较为显著，且在与肝癌细胞的共培养后同样可以观察到类似的效果；
5.PBMCs与SMMC-7721及Hep3B作用36h后，PD-L1的mRNA和蛋白水平均显著性的上升，但加入BBR不同浓度后均能观察到梯度的下降情况，以蛋白水平的下降较为显著；
6.正常肝癌细胞对BBR和PBMCs的作用均不敏感，BBR和PBMCs的联合作用具有肿瘤特异性。
【结论】
1.体外研究发现黄连素能促进正常健康人和肝癌患者PBMCs的抗肝癌效应。
2.黄连素能上调PBMCs中NK细胞频数。
3.PD-L1在黄连素促PBMCs抗肝癌作用中可能发挥重要作用。