【摘 要】
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随着能源的匮乏,纤维素作为可再生资源,含量丰富,纤维素酶水解纤维素成小分子物质生产燃料乙醇是当前刻不容缓的问题。微生物降解纤维素为人类利用纤维素资源提供了可能。在
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随着能源的匮乏,纤维素作为可再生资源,含量丰富,纤维素酶水解纤维素成小分子物质生产燃料乙醇是当前刻不容缓的问题。微生物降解纤维素为人类利用纤维素资源提供了可能。在地球上,真菌中的木霉属是分泌纤维素酶较多的微生物。本文以黄绿木霉(Trichoderma atroviride)AS3.3013菌株为实验材料,采用RT-PCR方法克隆出内切葡聚糖酶(EGⅡ)基因的cDNA序列,经测序为完整序列,在GenBank数据库登录号为KP098496,序列长度为1257bp,编码418个氨基酸,理论分子量为44.21k Da,理论等电点为4.96,信号肽为N端的21个氨基酸,是糖苷水解酶家族5的一种胞外酶。为了实现纤维素酶的高效表达,本研究构建了一种酿酒酵母高效重组表达载体YPIGH,将克隆到的EGⅡ基因连接到表达载体YPIGH和游离表达载体p YES2上,获得重组质粒YPIGH-EGⅡ和p YES2-EGⅡ,将重组质粒电转化入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVScⅠ中,测定内切葡聚糖酶酶活后,发现YPIGH-EGⅡ的酶活力比游离载体p YES2-EGⅡ的酶活提高了1.29倍。酵母转化子通过β-半乳糖诱导后,利用SDS-PAGE电泳分析,结果表明表达出目的蛋白,且大小基本符合理论值。研究采用实时荧光定量PCR的方法探究了黄绿木霉经不同底物诱导后的表达量和酿酒酵母转化子经β-半乳糖诱导后的表达量,研究表明:黄绿木霉在微晶纤维素(MCC)诱导下表达量最高,酿酒酵母转化子在第四天表达量最大。对重组酿酒酵母转子发酵条件进行优化,优化得到最佳产酶条件为:β-半乳糖含量为3%,YNB含量为0.84%,通氧量为100m L,培养温度为29℃时,重组酿酒酵母产酶量最大,最大产酶活性为116.10U/g。采用DNS法测定重组酶的酶活及酶动力学常数。结果显示:酶活最适温度为60℃,最适p H为5.0,在40-60℃范围内酶活稳定,p H在4.0-7.0之间具有较好的稳定性,Ag+对重组酶具有较强的激活作用,Co2+具有较强的抑制作用,蜜三糖为最佳底物。
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