米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶相比于其他的酶在空间上的选择性更强,即“双亲性”——位置和立体的选择。每种酶都有独特的应用领域和价值,脂肪酶也不例外,在能源化工、食品制造、化学合成等跨领域学科中,都能找到它的应用踪迹。另一方面,由于高效脂肪酶的工艺相对复杂,导致生产成本相对较高,随之而来的弊端就是限制了其在生物柴油、粮食加工、有机合成等领域的发展。同时为了说明,在占据市场竞争力、更贴合环保理念、更突显经济节约等方面,酶的优势远远高于化学法,利用基因工程、分子生物学、蛋白质工程等技术手段,人为构建一株酶活力相对较高、蛋白表达量相对优异的脂肪酶基因工程菌株,拟在提高脂肪酶在实际工业生产中的应用水平,显得格外迫切和必要。根据Gen Bank(1LGY)中的原始基因序列,我们的脂肪酶基因是人工合成的,它来源于米根霉,属于微生物来源的一类。尽管在实验中,我们也尽可能的做了改造,提高它的外源表达水平,但是除去人为因素,其他因素也比较多,需要将多种技术手段,综合起来考虑。我们着重探究了,基因剂量、结构域优化对其表达程度的影响。选取了毕赤酵母作为表达宿主,结合发酵工艺、产酶条件等方面,对重组体的活性及蛋白含量做了测定,情况如下。1.原始ROL基因重组表达菌株在摇瓶发酵水平下的最高酶活和蛋白含量分别为260 U/mL,0.14 mg/mL,优化后,指标有一定的提升,酶活和蛋白含量分别为560 U/mL,0.28 mg/mL。2.对优化后的脂肪酶基因构建多拷贝串联体,单拷贝脂肪酶ROL平均酶活为205 U/mL,二拷贝脂肪酶ROL平均酶活为960 U/mL,三拷贝重组菌ROL平均酶活为1,250 U/mL。单拷贝脂肪酶ROL平均蛋白含量为0.24 mg/mL,二拷贝脂肪酶ROL平均蛋白含量为0.37 mg/mL,三拷贝脂肪酶ROL平均蛋白含量为0.42 mg/mL。可见,随着基因剂量的提高,酶活力和蛋白含量均呈现递增趋势。3.对多拷贝摇瓶发酵最优的重组菌株进行50L发酵罐条件下的产酶试验。发酵罐条件下,其活性最高的为26,500 U/mL,与原始基因最优单拷贝酶活相较,酶活力提高101倍,蛋白含量提高20倍。就目前以上的一些数据能够从一定程度上反应,对外源基因进行必要的分子改造,能赋予酶一些新的特性。朝着人们所期望的方向发展,这些技术手段,包括,累积基因拷贝数,这会涉及到构建高拷贝载体,另外,也可以进行蛋白结构域优化,包括增加蛋白质的稳定性等。考虑到影响毕赤酵母表达的因素较多,往往单一的优化因素,在定向改造中的效果十分有限,因此,在实际的操作中需要联合多种技术手段才能达到预期的实验效果。