研究背景与目的 血管内膜损伤以及损伤后修复过程缓慢是多种介入术后再狭窄病理生理基础,如下肢动脉球囊扩张术、经皮冠状动脉支架置入术等。血管内膜的破坏,增加血管感染、脂质沉淀、血栓形成的风险,导致内膜病理性增厚及血管壁重塑,最终导致血管狭窄形成。由此可见,加速损伤血管的早期的再内皮化,在避免术后再狭窄形成中有着重要的作用。内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞,多项体内外的研究证明其可促进损伤后的血管内膜修复,经典的理论认为其机制有如下两方面,一是直接分化为成熟的血管内皮细胞,二是增加残存的内皮细胞的增殖及迁移能力以促进内膜新生。近年来,多项实验研究显示,内皮祖细胞促进内膜新生主要是其通过分泌多种遗传物质、细胞因子等旁分泌途径促进残留的血管内皮细胞的增生,而内皮祖细胞直接分化为成熟的血管内皮细胞是微不足道的。外泌体是一种直径为40-100纳米的圆形或椭圆形膜性结构,是旁分泌机制的重要成分,通过转运蛋白质、脂质、RNAs等物质在细胞间通讯中起着重要作用。最近有研究证实,从间充质干细胞及心肌前体细胞来源的外泌体,可以触发血管新生和恢复局部受损组织功能,这说明外泌体在干细胞的旁分泌机制中扮演重要角色。基于以上理论,我们推定内皮祖细胞在促进血管内膜损伤后的修复中,外泌体参与的旁分泌机制起着重要作用。本实验中,我们首先从人类脐带血中分离纯化内皮祖细胞,随后从内皮祖细胞的培养液中提取外泌体;动物实验部分,我们成功制作大鼠颈动脉球囊损伤模型,然后通过鼠尾静脉注射外泌体,观察其对血管再内皮化及内膜增生的作用;机制研究部分,我们着重研究内皮祖细胞来源的外泌体对血管内皮细胞的增殖、迁移、成管等功能的影响,通过q RT-PCR探讨外泌体对血管新生相关基因的表达的影响。实验方法 1.内皮祖细胞及其来源的外泌体的分离及鉴定1.1密度梯度离心法分离诱导内皮祖细胞:人类脐带血稀释后平铺于人淋巴细胞分离液Histopaque 1077,取中间白膜层即为单个核细胞,培养皿用鼠尾胶原包被,培养于特殊的EGM-2 MV诱导培养液中。1.2选取培养培养至2-3代的EPCs进行鉴定,免疫荧光检测细胞表面特异性蛋白v WF、CD31和CD34表达。1.3利用流式细胞分析技术分别检测CD31、CD34、CD133、CD144、CD146和CD45在细胞表面的表达。1.4荧光检测内皮祖细胞摄取乙酰化低密度脂蛋白以及结合荆豆凝集素。1.5内皮祖细胞在无血清的培养液中培养48小时,用超速离心法提取培养液中的外泌体,BCA法检测其蛋白浓度。1.6在透射电镜下观察外泌体的形态、直径等。1.7 Western Blotting检测,人类脐带血来源的内皮祖细胞外泌体是否表达进化保守蛋白CD9、CD63和CD81。2.EPC-Exo对大鼠颈动脉内膜损伤后的修复作用2.1大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立2.2伊文氏蓝染色来观察EPC-Exo对损伤血管第14天及21天再内皮化的作用,无内皮细胞处被伊文氏蓝染成蓝色,有内皮覆盖则不能被染色,选用再内皮化面积/动脉总面积这一比值作为评价参数。2.3通过HE染色,石蜡切片后,计算血管内膜和中膜横断面的面积以及内中膜面积比,来检测外泌体对大鼠颈动脉损伤后内膜增生的影响。3.体外检测EPC-Exo对内皮细胞功能的影响及其机制3.1荧光显微镜观察内皮细胞对荧光标记的外泌体的吸收作用。3.2 CCK8法检测外泌体对内皮细胞增殖作用的影响。3.3划痕试验检测外泌体对内皮细胞迁移能力的影响。3.4 Metrigel法检测外泌体对内皮细胞成管作用的影响。3.5 q RT-PCR法检测外泌体对内皮细胞表达血管新生相关基因的影响。实验结果 1.成功分离获取内皮祖细胞及外泌体1.1脐带血分离诱导的细胞培养4天后,细胞培养板中可见椭圆形或梭形的贴壁细胞;继续培养至第7-10天,梭形的细胞逐渐消失,其余贴壁细胞呈圆形,可见典型的内皮细胞样集落形成;培养14-21天后,各集落融合,细胞呈鹅卵石样。1.2免疫荧光检测细胞表面EPCs特异性蛋白v WF、CD31和CD34表达,>90%细胞呈阳性。1.3利用流式细胞分析技术检测,结果显示CD31、CD34、CD133、CD144及CD146在培养细胞中的阳性率分别为98.16%、87.81%、79.14%、97.32%和94.16%,CD45的阳性率为0.2%,可以认为本实验获得纯度较高的EPCs1.4荧光显微镜观察显示内皮祖细胞能够摄取乙酰化低密度脂蛋白及结合荆豆凝集素,且大多数细胞呈双阳性。1.5通过高速离心法,从无血清的内皮祖细胞培养中成功提取到外泌体,使用BAC法定量样品蛋白浓度为(200±60)μg/ml。1.6在透射电镜下观察,可见外泌体呈圆形或椭圆形,直径大小为30-100nm。1.7 Western Blotting结果显示,人类脐带血来源的内皮祖细胞外泌体表达进化保守蛋白CD9、CD63和CD81。2.外泌体对球囊损伤血管再内皮化及内膜形成的影响2.1本实验通过伊文氏蓝染色来观察外泌体对损伤血管第14天及21天再内皮化的作用,选用再内皮化面积/动脉总面积这一比值作为评价参数。实验组和对照组大鼠,在术后第14天时有明显的统计学差异(87.66±12.3%vs.53.37±10.3%;n=8;P<0.05),说明EPC-Exo可促进损伤血管在早期的再内皮化,但在第21天时并无明显统计学差异(90.65±12.1%vs.92.42±11.6%;n=8;P<0.05)。2.2本实验使用Leica Qwin图像分析软件,计算血管内膜和中膜横断面的面积以及内中膜面积比,来检测外泌体对大鼠颈动脉损伤后内膜增生的影响。实验组和对照组大鼠,在术后第14天时有明显的统计学差异(0.282±0.11 vs.0.587±0.10;n=8;P<0.05),说明外泌体可抑制被损伤血管在早期的内膜增生,但在第21天时并无明显统计学差异(0.885±0.33 vs.1.245±0.17;n=8;P<0.05)。3.外泌体促进内皮细胞功能3.1免疫荧光结果显示,内皮细胞使用含绿色荧光Dio标记的EPC-Exo的培养基培养2小时后,可见荧光颗粒聚集于DAPI染色的细胞核周围,说明内皮细胞能够内吞外泌体进入细胞内。3.2 CCK8法结果显示:对照组内内皮细胞增殖缓慢,而外泌体干预组内的内细胞增殖速度较快,曲线较为陡直。比较各时间点两组的吸光度值可见,从第2天开始,实验组的吸光度值较对照组的吸光度值即有显著的统计学差异(P<0.05)。3.3划痕实验结果显示,培养8小时后,外泌体干预组的内皮细胞的迁移指数为0.612±0.033,而对照组为0.336±0.028,统计结果具有统计学意义(P<0.05)。本实验表明外泌体可以显著促进内皮细胞迁移。3.4 Matrigel法检测结果显示:4小时后,对照组和外泌体干预组均可见管样结构,管长分别为9.554±1.672mm和15.131±1.833mm,分支数分别为38.615±3.293和51.984±4.665,两组有统计学差异(P<0.05);8小时后,两组的管长和分支数仍有统计学差异。3.5内皮细胞在含外泌体的培养基中培养24小时后,多种血管新生性基因(e NOS,IL-8,ANG-1,E-selectin,VEGFA,VEGFR-2,HIF-1a,CXCL16,PDGFA)表达成倍增加,与对照组有显著统计学差异。实验组基质金属面MMP9基因表达较对照组显著下降,有统计差异(P<0.05)。总结 综合以上结果,本实验成功从人类脐带血中分离获取内皮祖细胞,并从内皮祖细胞的培养液中成功分离提取外泌体;外泌体可以促进球囊损伤血管早期的再内皮化和抑制内膜病理性增生;外泌体在内皮祖细胞的旁分泌机制中有着重要作用,通过促进多种血管相关性基因的表达,增强内皮细胞的增殖、迁移、成血管样结构等功能,从而加速血管损伤后再内皮化。