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过量摄入高热量糖,如葡萄糖、果糖和蔗糖等会导致肥胖、糖尿病、心脑血管疾病和高血压等慢性疾病,已引起世界范围内的广泛关注。来源于植物甜叶菊的甜味剂莱鲍迪苷D（rebaudioside D,Reb D）和莱鲍迪苷M（rebaudioside M,Reb M）因其低热量、高甜度、低回苦味等独特性质而受到消费者青睐,是高热量糖的理想替代品,被广泛应用于食品行业。然而Reb D和Reb M在甜叶菊中含量低,利用传统萃取方法从植物中提取制备不仅生产成本高且产量难以满足市场需求。为此,根据其生物合成途径开发相应酶转化方法,实现以甜叶菊中含量高的甜菊糖和莱鲍迪苷A（rebaudioside A,Reb A）合成莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M具有重要的应用价值。但是,在酶转化方法中负责催化合成Reb D和Reb M的糖基转移酶存在可溶性表达水平差和催化活性低等问题,这也限制了酶法合成Reb D和Reb M的应用。为此,本论文通过挖掘筛选得到一种能够催化Reb A合成Reb D的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168来源的糖基转移酶Yoj K,该酶可以在大肠杆菌表达系统中实现良好的可溶性异源重组表达。通过对该糖基转移酶进行蛋白质结构解析、催化机制以及催化活性改造的研究,提高了其催化活性。此外,本论文还通过基于蛋白质结构的理性改造提高催化合成Reb M的糖基转移酶UGT76G1的催化活性,并研究其催化活性提高的机制。主要研究成果如下:1.获得一种具有催化Reb A合成Reb D活性的细菌来源的新糖基转移酶Yoj K为了获得能够高效催化Reb A合成Reb D的糖基转移酶,选取6种不同来源的糖基转移酶Yoj K、Ydh E、Os UGT、BCGT-1、UGT73AE1以及UGT72E2。在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了异源重组表达,测试了它们对Reb A的催化活性,通过液相色谱质谱联用（LC-MS）与核磁共振波谱（NMR）技术手段确定了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168来源的糖基转移酶Yoj K能够糖基化修饰Reb A变为Reb D。Yoj K催化Reb A合成Reb D的Km为210±11.70μM,kcat为1.08±0.05 min-1。2.解析了糖基转移酶Yoj K的蛋白质结构并理性改造实现了Reb D的高效合成为了提高Yoj K的催化活性,通过蛋白质结晶条件的筛选和优化,获得了Yoj K蛋白质晶体并解析了其蛋白质结构。Yoj K蛋白质结构分辨率为1.9（?）,空间群为P 1 21 1,PDB登录号为7VM0。基于Yoj K蛋白质结构进行分子对接获得可能与Reb A结合的位点,通过丙氨酸扫描突变、定点饱和突变以及组合突变的策略获得了突变体Yoj K-I241T/G327N,其催化活性是野生型Yoj K的7.35倍。突变体Yoj K-I241T/G327N催化Reb A合成Reb D的Km为193.07±7.30μM,kcat为10.76±0.05 min-1。相比于野生型Yoj K,突变体Yoj K-I241T/G327N的Km值降低,kcat升高,kcat/Km显著升高,说明突变体Yoj K-I241T/G327N的催化活性显著提高。通过分子动力学模拟解释了突变体Yoj K-I241T/G327N催化活性提高的机制,即突变体Yoj K-I241T/G327N通过与Reb A以及尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）形成新的氢键,使其在催化过程中与Reb A以及UDPG保持更加稳定和更加有利于反应发生的构象。最后,通过优化突变体Yoj K-I241T/G327N与蔗糖合酶At Su Sy的级联反应条件,在最优条件下反应15 h后,催化19.32 g·L-1 Reb A合成了20.59 g·L-1 Reb D,产率为91.29%。3.理性改造糖基转移酶UGT76G1实现了Reb M的高效合成为了提高UGT76G1的催化活性,通过基于UGT76G1蛋白质结构的分子对接并选取与底物Reb D可能有相互作用的氨基酸残基位点,以UGT76G1-T284S为出发酶,采用丙氨酸扫描突变、定点饱和突变以及组合突变的策略对UGT76G1进行改造,最终获得了催化活性为出发酶UGT76G1-T284S 2.38倍的突变体UGT76G1-T284S/M88L/L200A。酶动力学实验表明突变体UGT76G1-T284S/M88L/L200A催化Reb D合成Reb M的Km为324.25±7.33μM,kcat为2.39±0.05 s-1。与UGT76G1-T284S相比,突变体UGT76G1-T284S/M88L/L200A的Km值减少,kcat值增加,说明在该突变体中,底物与酶的亲和力增强,催化活性显著升高。通过分子动力学模拟证明了突变体UGT76G1-T284S/M88L/L200A改变了与Reb D二萜骨架结构结合的疏水口袋的形状和大小,缩短了Reb D与UDPG以及酶催化活性位点H25的距离,使底物与酶的构象更利于β-1,3糖苷键的形成。构建并优化突变体UGT76G1-T284S/M88L/L200A与蔗糖合酶At Su Sy级联反应的条件,通过底物补料进行Reb M的制备。在反应7 h时,催化22.58 g·L-1 Reb D合成了23.37 g·L-1的Reb M,产率为90.50%。总之,本论文中通过基于蛋白质结构的理性改造糖基转移酶Yoj K和UGT76G1,并构建和优化级联反应体系实现了Reb D和Reb M的高效合成,为规模化生产Reb D和Reb M奠定了基础。