第一章:鉴定在子宫细胞中调控CORIN基因表达的关键启动子研究目的:Corin是一种首先在心脏中发现的II型跨膜丝氨酸蛋白酶,其主要功能是将心房利钠肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)转化成具有生物学活性的心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)。在小鼠和人妊娠期子宫蜕膜细胞中corin m RNA和蛋白表达显著提高。高表达的corin m RNA提示corin在妊娠期子宫组织中存在转录水平的表达调控,但迄今其分子机制尚不明确。人CORIN基因5’端区域内存在一些进化上保守的转录因子结合位点,包括TBX5、GATA、Nkx2-5、KLF(Krüppel-like transcription factor)等转录因子结合位点。目前已知心脏中corin表达受GATA-4转录因子调控,但子宫中CORIN基因转录调控的机制尚不清楚。本章节旨在通过体外实验研究人CORIN基因启动子在子宫细胞中的功能,分析其与在心肌细胞中的机制有何不同,探究corin在妊娠子宫组织中转录调控的分子机制。研究方法:采用人CORIN基因启动子驱动的荧光素酶表达系统,利用表达corin的心肌HL-1细胞和子宫内膜癌AN3-CA细胞,研究CORIN基因启动子的功能。以空质粒p GL-3为荧光素酶载体对照,p RV-SV40作为内参照,将逐级截短的人CORIN基因启动子驱动的Firefly荧光素酶表达质粒,分别为h Cp1297Luc、h Cp405Luc、h Cp236Luc及h Cp161Luc,用Lipofectamin 2000转染HL-1或AN3-CA细胞,40 h后检测Firefly和Renilla荧光,计算基于相对荧光素酶强度的启动子活性。研究结果:1.逐级截短的人CORIN基因启动子h Cp1297、405、236和161可以在心肌HL-1细胞中表达,它们的活性无显著差异。2.人CORIN基因启动子h Cp405上的GATA序列突变为CTTA后,在心肌HL-1细胞中启动子活性显著下降。3.人CORIN基因启动子h Cp1297、405和236在子宫AN3-CA细胞中具有类似的表达活性,但不包含KLF结合位点的h Cp161活性显著下降。4.KLF结合位点序列突变可使CORIN基因启动子在子宫细胞中的活性显著下降。结论:本章节研究显示,人CORIN基因在心脏和子宫细胞中的转录调控机制不同。心脏细胞中CORIN基因启动子活性依赖于GATA序列,而子宫细胞中CORIN基因启动子活性则依赖于两个KLF结合位点。KLF转录因子与该两个KLF结合位点可能是调控子宫corin转录的重要分子机制。第二章:KLF转录因子在妊娠子宫中的表达及对CORIN基因的转录调控研究目的:在第一章的研究中,我们发现KLF转录因子结合位点对于CORIN基因启动子在子宫细胞中的活性至关重要,但KLF结合位点与KLF转录因子家族中的哪一种或那几种因子结合尚不明确。KLF转录因子家族由17个成员组成,能够与基因组DNA结合,调节基因表达,从而调控多种生物学过程。本章研究旨在探究参与子宫组织中CORIN基因转录调控的主要KLF转录因子。研究方法:1.采用手术双侧卵巢切除的小鼠去势模型,用溶剂对照、雌激素、孕激素及雌孕激素分别皮下注射小鼠。提取小鼠子宫组织RNA,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测corin及KLF转录因子的m RNA表达水平。2.提取未妊娠、G(gestation)4.5-18.5 d(day,天)的小鼠子宫RNA,采用q RT-PCR检测corin及KLF转录因子的表达水平。3.收集未妊娠与妊娠早期(6-7 w,周)的人子宫内膜组织,提取RNA,采用q RT-PCR检测corin及KLF转录因子的表达水平。4.选取可能的候选KLF转录因子,分别与空载体p GL-3、逐级截短的人CORIN基因启动子、KLF结合位点突变的人CORIN基因启动子以及p RV-SV40载体共同转染HL-1或AN3-CA细胞,40 h后检测Firefly和Renilla荧光,计算相对荧光素酶强度。研究结果:1.与溶剂对照组相比,孕激素组小鼠子宫组织中corin表达水平提高,雌激素组、雌孕激素组小鼠子宫组织中corin表达水平未见显著差异。提示:注射孕激素可提高小鼠子宫组织中corin m RNA表达。2.与溶剂对照组相比,孕激素组小鼠子宫组织中corin表达水平提高的同时KLF2、9、15和17的表达也相应提高,而KLF家族中其余成员的表达未见显著提高。提示:孕激素上调了小鼠子宫组织中corin以及KLF2、9、15和17的m RNA的表达。3.与未妊娠小鼠相比,妊娠小鼠子宫组织corin表达水平增强,在G12.5和G18.5 d时差异显著。KLF2、9、15和17在孕期中表达显著上升,其中KLF2和17的表达上升早于corin的表达上升。4.早期妊娠妇女(6-7 w)子宫内膜组织corin表达水平显著高于未妊娠对照,其子宫KLF2及KLF17表达水平也显著升高,并且KLF2、17与corin表达水平之间呈正相关。5.与空载体对照相比,在子宫AN3-CA细胞中,分别过表达KLF2和17可显著提高CORIN基因启动子活性,而分别过表达KLF9或15无此效应。当CORIN基因启动子序列中KLF结合位点缺失或突变时,KLF2、9、15和17过表达后CORIN基因启动子活性不增高。6.与空载体对照相比,在HL-1细胞中分别过表达KLF2、9、15和17后,CORIN基因启动子活性无明显改变。结论:本章节研究显示,KLF2、9、15和17在孕激素诱导的去势小鼠和妊娠小鼠子宫组织中表达提高。Corin、KLF2和17在妊娠早期的人子宫组织中表达升高,且KLF2和17表达水平与corin表达水平呈正相关。过表达KLF2和17在体外实验中能提高子宫细胞中CORIN基因启动子活性。在心肌细胞中,KLF2和17不能增强CORIN基因启动子活性。提示KLF2和17可能参与在妊娠期子宫组织中corin的转录调控机制。第三章:KLF17在妊娠子宫中对CORIN基因的转录调控作用研究目的:在第二章的研究中,我们发现妊娠子宫中KLF2和17表达水平提高并且与子宫组织corin表达增强同步,在子宫细胞中KLF2和17的表达具有提高CORIN基因启动子活性的作用。本章节旨在探究KLF2和17在子宫细胞CORIN基因的转录调控中所起的作用,从而揭示CORIN基因子宫转录调控的分子机制。研究方法:1.对人子宫内膜基质细胞(human endometrial stromal cell,HESC)进行蜕膜化后的不同时间点,用q RT-PCR检测蜕膜化标志物催乳素(prolactin)和corin的m RNA表达水平。2.用Western blotting和免疫细胞化学方法检测人子宫内膜基质细胞HESC在诱导蜕膜化后,corin、KLF2及17的蛋白表达水平和细胞内分布情况。3.用免疫荧光方法检测人子宫内膜基质细胞HESC在诱导蜕膜化后,corin和KLF17的蛋白表达水平和表达分布的变化。4.用免疫组织化学的方法检测小鼠不同妊娠期子宫组织中corin和KLF17的蛋白表达水平和组织分布的变化。5.用染色质免疫共沉淀方法检测人子宫内膜基质细胞HESC在诱导蜕膜化前后,KLF2和17与CORIN基因启动子序列的结合能力。6.利用CRISPR-Cas9技术构建KLF17基因敲除(knockout,KO)的HESC细胞系,提取基因组DNA进行PCR鉴定,提取蛋白裂解液进行Western blotting鉴定。7.对野生型HESC细胞和KLF17-KO细胞进行诱导蜕膜化,用q RT-PCR检测corin m RNA在细胞中的表达水平。8.收集正常未孕、正常妊娠和子痫前期妇女子宫内膜组织,用q RT-PCR方法检测组织中corin和KLF17的表达水平。9.利用基因打靶技术建立KLF17基因敲除小鼠,并进行初步鉴定。研究结果:1.q RT-PCR检测蜕膜化标志物催乳素(prolactin)和corin在体外诱导蜕膜化的人子宫内膜基质细胞HESC中表达水平。在诱导12 h后,催乳素(18.58±1.38倍)和corin(9.33±0.37倍)表达水平均显著提高,并持续至少72 h。免疫细胞化学检测发现corin蛋白高表达于细胞膜上。提示corin在诱导蜕膜化的HESC中表达增强,故HESC可以作为研究corin转录调控的子宫内膜模式细胞。2.Western blotting检测KLF17蛋白表达水平,发现其在诱导蜕膜化12 h至72h时维持高水平表达。免疫细胞化学检测发现诱导蜕膜化后KLF17高表达于细胞核区域中。Western blotting检测KLF2蛋白表达水平,发现在诱导蜕膜化后的不同时间点其表达水平无显著变化(P>0.05)。免疫细胞化学检测未见KLF2蛋白表达水平和表达分布有明显变化。3.免疫荧光染色在未诱导蜕膜化的HESC细胞中检测不到的corin及KLF17表达。诱导蜕膜化12 h后可在细胞浆中检测到corin表达,在细胞浆和细胞核中检测到KLF17表达。诱导蜕膜化72 h后可在细胞浆中检测到corin表达,而KLF17则主要表达于细胞核中。4.免疫组化发现corin和KLF17低表达于未妊娠小鼠子宫内膜腔上皮细胞中。G4.5至18.5 d小鼠子宫内膜腔上皮细胞和腺上皮细胞中均可检测到corin和KLF17同时表达,且其表达水平逐渐增强。提示corin与KLF17蛋白有相似的表达模式。5.染色质免疫共沉淀(Ch IP)分析发现,在未诱导蜕膜化的HESC中,未能检测到KLF2、9和17与CORIN基因启动子结合。在诱导蜕膜化后的HESC中,抗KLF17抗体免疫沉淀物中的染色质片段,能够检测到CORIN基因启动子中KLF结合位点特异性片段。而抗KLF2或9抗体免疫沉淀物中,结果阴性。q PCR实验也支持上述实验结果。提示在HESC细胞中,KLF17可与CORIN基因启动子序列结合。6.基因水平与蛋白水平鉴定显示,两株KLF17-KO的HESC细胞系中KLF17基因敲除,无KLF17蛋白表达。7.将HESC细胞系和KLF17-KO细胞系分别进行诱导蜕膜化,q RT-PCR检测发现在诱导蜕膜化72 h后,野生型HESC细胞中corin表达显著增强,两株KLF17-KO细胞系中corin表达在诱导前后未见显著变化。提示KLF17可调节corin在诱导蜕膜化HESC中的表达。8.正常人妊娠子宫内膜组织中corin表达显著高于未孕子宫,而子痫前期患者子宫组织中corin表达显著低于正常妊娠子宫。同时,子痫前期患者子宫组织中KLF17的表达低于正常妊娠子宫。提示KLF17在子宫组织中表达降低可能影响子痫前期患者子宫组织中corin的表达。9.建立了KLF17基因敲除小鼠模型,初步观察显示其具有发育、生存及生殖能力。在该小鼠模型中,子宫corin的表达及螺旋动脉的重塑正在研究进行中。结论:通过本章节的研究,我们通过体外细胞实验发现KLF17在子宫细胞诱导蜕膜化过程中高表达,其表达水平增强与corin表达水平增强在时间上一致。高表达的KLF17进入细胞核中,与CORIN基因启动子序列上的KLF结合位点相互作用。KLF17敲除后,子宫细胞诱导蜕膜化时的corin表达被抑制。子痫前期患者子宫组织中KLF17的表达低于正常妊娠子宫,可能是子痫前期患者子宫组织中corin表达显著低于正常妊娠子宫的原因之一。综上所述,CORIN基因在妊娠子宫的表达上调,对子宫螺旋动脉重塑、促进母体与胎儿之间的血供以及防止子痫前期的发生具有重要作用。本论文旨在研究CORIN基因在子宫细胞中的转录调控分子机制。通过体外分子生物学和细胞学研究,小鼠模型实验,以及人子宫组织分析,我们发现KLF17在CORIN基因的转录调控中起关键作用。我们的结论是基于以下实验结果:1)CORIN基因启动子含有两个保守的KLF结合位点,它们为CORIN基因在子宫细胞中表达所必须的,提示KLF转录因子参与了corin在子宫细胞中表达的转录调控;2)在孕激素诱导的去势小鼠子宫组织以及正常妊娠小鼠子宫组织中,KLF17表达增强,且其表达增强先于corin的表达,另外,KLF17与corin均表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮中;3)在人子宫AN3-CA细胞中,过表达KLF17可提高CORIN基因启动子活性;4)在体外诱导的人子宫蜕膜细胞中,KLF17表达增强可与CORIN基因启动子序列结合;5)在人子宫蜕膜细胞系中,敲除KLF17基因,corin不能被诱导表达;6)在正常妊娠早期的人子宫内膜组织中,KLF17与corin的表达呈正相关;7)在子痫前期患者的子宫内膜组织中,KLF17与corin表达均下降。我们的这些结果表明,KLF17可能是调控corin在妊娠期子宫组织中表达的一个关键转录因子。KLF17的表达降低或功能缺失,可能阻止CORIN基因在妊娠子宫组织中的表达上调,从而无法促进子宫螺旋动脉的重塑,进而导致子痫前期的发生和发展。我们的研究发现对corin的生理功能及其在妊娠疾病中的病理机制具有重要的生物学和临床意义。