论文部分内容阅读
目的:通过动物实验,对比观察补阳还五汤(Buyanghuanwu Tang,BYHWT)及其拆方,在保护脑缺血小鼠海马神经元、抗氧化应激损伤和调控凋亡相关基因Bax、bcl-2蛋白表达等方面的作用,以寻求该方抗脑缺血损伤的有效组分,探讨该方配伍的结构和意义,并为防治脑缺血性疾病中药新药的研发探讨一些新的思路。方法:将120只清洁级昆明小鼠随机分为6组:假手术组、模型组、补阳还五汤全方组和补气活血(Buqihuoxue,BQHX)组、补气通络(Buqitongluo,BQTL)组、活血通络(Huoxuetongluo,HXTL)组,每组20只。各中药组分别以相应中药煎剂,按小鼠体重15ml/Kg灌胃(BYHWT全方组、BQHX组、BQTL组、HXTL组分别相当于21.45、20.10、19.35、3.45g/Kg生药),假手术组和模型组灌服等量生理盐水,每日1次,直至实验结束。于第3日给药后2h,所有小鼠经10%水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉,取仰卧位固定于手术台上,颈部正中切口,钝性分离肌肉组织与血管,充分暴露双侧颈总动脉,术中注意保护迷走神经,模型组和各中药组均以微动脉夹阻断双侧颈总动脉血流30 min,然后恢复灌流,逐层缝合;假手术组仅暴露双侧颈总动脉30min,不阻断血流。术中及术后注意保暖,待动物清醒后放回笼中饲养,正常饮食,继续灌胃同前。术后24h各组随机选取10只小鼠断头处死,迅速剥取全脑,用手术刀片沿大脑纵裂将大脑左右半球分离,左侧半球低温保存,分别采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法检测脑组织SOD活性及MDA含量;右侧半球以10%甲醛溶液固定,常规石蜡切片,免疫组化方法检测、并用Motic Med 6.0图像分析系统分析Bax和bcl-2蛋白表达。其余小鼠于术后7d全部断头处死,迅速剥取全脑,冠状切取视交叉后1~4mm脑片,10%甲醛溶液固定,常规石蜡切片,HE染色,光镜下观察海马CA1区组织学分级并计数神经元密度(Neuronal density,ND)。结果:1术后7d海马CA1区组织病理学改变模型组海马CA1区损伤明显,组织学分级多为2级和3级,明显高于假手术组(多为0级和1级,P<0.01),提示延迟性神经元死亡(Delayed neuron death,DND)严重。各中药组海马CA1区损伤相对轻微,组织学分级多为0级、1级和2级,均明显低于模型组(P<0.05或P<0.01),其中补阳还五汤全方组、补气活血组及补气通络组组织学分级又明显低于活血通络组(P<0.05或P<0.01),而前三者之间无明显差异(P>0.05)。通过计数海马CA1区神经元密度发现:与假手术组(211±16n/mm)相比,模型组神经元密度(72±22n/mm)明显降低(P<0.01);与模型组比较,补阳还五汤全方(188±19n/mm)及各拆方组神经元密度均明显升高(P<0.05或P<0.01),其中补阳还五汤全方组、补气活血组(175±20n/mm)和补气通络组(178±16n/mm)神经元密度又较活血通络组(119±17n/mm)明显升高(P<0.01),而前三者之间无明显差异(P>0.05)。2术后24h脑组织SOD活性和MDA含量变化与假手术组(SOD:23.39±2.60 U/mgprot,MDA:1.204±0.157 nmol/mgprot。单位下同)比较,模型组动物脑组织SOD(8.01±1.66)活性明显降低(P<0.01),MDA含量(1.966±0.313)明显升高(P<0.01);与模型组比较,补阳还五汤全方(SOD:22.55±2.37,MDA:1.297±0.199)及各拆方组SOD活性均明显升高、MDA含量均明显降低(P<0.05或P<0.01),其中补阳还五汤全方组、补气活血组(SOD:21.28±1.92,MDA:1.352±0.146)和补气通络组(SOD:21.37±2.32,MDA:1.321±0.152)又较活血通络组(SOD:11.38±2.00,MDA:1.788±0.155)SOD活性明显升高、MDA含量明显降低(P<0.01),而前三者之间无明显差异(P>0.05)。3术后24h海马CA1区Bax和Bcl-2蛋白表达假手术组海马CA1区Bax(0.1438±0.0145。AOD值,下同)及Bcl-2(0.2008±0.0209)蛋白呈微弱表达,与之相比,模型组Bax蛋白表达(0.3883±0.0310)明显增强(P<0.01),Bcl-2蛋白表达(0.2177±0.0316)亦可见增加,但无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,补阳还五汤全方(Bax:0.2035±0.0212,Bcl-2:0.3807±0.0328)及各拆方组Bax表达均明显减弱(P<0.05或P<0.01),Bcl-2表达均明显增强(P<0.01),其中补阳还五汤全方组、补气活血组(Bax:0.2187±0.0250,Bcl-2:0.3616±0.0258)和补气通络组(Bax:0.2188±0.0211,Bcl-2:0.3629±0.0290 )又较活血通络组(Bax:0.3499±0.0294,Bcl-2:0.2779±0.0331)Bax表达明显减弱、Bcl-2表达明显增强(P<0.01),而前三者之间无明显差异(P>0.05)。结论:1小鼠脑缺血30min再灌注7d,可致明显的海马组织损伤,表现为海马CA1区组织学分级升高,神经元密度降低。补阳还五汤及其拆方均能在一定程度上减轻脑缺血引起的海马组织损伤,以补阳还五汤全方作用最明显,其中补气活血和补气通络效果优于活血通络,提示补阳还五汤中的补气药可能是其抗脑缺血损伤作用的最有效组分。2补阳还五汤及其拆方均能在一定程度上提高小鼠缺血脑组织SOD活性,降低MDA含量,以补阳还五汤全方作用最明显,其中补气活血和补气通络效果优于活血通络,提示补阳还五汤能够明显增强缺血脑组织抗氧化应激损伤的能力,减轻过氧化产物对神经元的伤害性刺激,从而起到保护神经元的作用,在此过程中,方中补气药可能扮演了最重要的角色。3补阳还五汤及其拆方均能在一定程度上使脑缺血海马组织Bax蛋白表达下调、Bcl-2蛋白表达上调,以抑制细胞凋亡从而减轻DND,这可能是补阳还五汤及其拆方抗脑缺血损伤作用的重要机制之一。其中,以补阳还五汤全方作用最明显,补气活血和补气通络效果优于活血通络,提示方中补气药可能起到了最关键的作用。