哮喘是一种常见、多发以慢性气道炎症和气道高反应为特征的异质性疾病,发病率在全球范围内都有上升趋势。哮喘患者早期症状如果不能有效控制便会持续进展,给患者家庭和社会带来沉重的医疗经济负担。目前临床上大多数哮喘可以得到有效控制,部分慢性难治性哮喘对糖皮质激素不敏感,已经成为哮喘研究中的一个难点,而气道结构重塑是哮喘难以治愈的重要原因。气道结构重塑在哮喘早期即可出现,一旦形成,便持续进展,使气道管腔缩窄,从而导致哮喘严重发作。气道结构重塑已成为哮喘研究的热点,然而其发病机制尚不完全清楚,也无有效的干预措施。气道上皮细胞作为隔绝外界有害物质的物理和功能屏障,其损伤、异常修复在哮喘发生、进展中发挥重要作用。本研究着眼于哮喘环境下气道上皮细胞神导向因子2（Slit2）的变化,深入探讨相关机制,以期为临床哮喘的治疗提供一些借鉴性的理论依据。第一部分Slit2在哮喘气道上皮细胞的表达情况目的:明确Slit2在哮喘气道上皮细胞中的表达情况,为后续研究奠定基础。方法:采用OVA复制哮喘小鼠模型,HE观察小鼠肺组织病理,免疫组化观察小鼠气道上皮细胞Slit2基因表达情况;利用GEO数据库基因表达谱芯片结果,采用GCBI在线分析对哮喘患者气道上皮刷检细胞的表达谱芯片数据深入挖掘,分析哮喘患者气道上皮细胞Slit2基因表达变化;体外采用Der p2刺激人支气管上皮细胞BEAS-2B,检测变应原刺激下BEAS-2B细胞株内Slit2基因表达情况。结果:免疫组化结果显示,哮喘小鼠气道上皮细胞Slit2基因表达明显减少;生物信息学分析结果表明,哮喘患者刷检气道上皮细胞内Slit2基因转录水平显著降低;体外气道上皮细胞株Der p2依赖性下调Slit2基因表达。结论:气道上皮细胞Slit2表达受环境变应原刺激的影响,在哮喘气道上皮细胞内Slit2基因下调表达,这有可能成为哮喘早期临床诊断的重要指标。第二部分Slit2在哮喘气道上皮细胞下调表达的机制探讨目的:旨在探讨哮喘Slit2基因启动子甲基化变化情况,DNA甲基化水平的变化在气道上皮细胞内Slit2基因表达下调中的作用,及甲基化转移酶抑制剂对哮喘小鼠肺组织的影响,为进一步阐明哮喘发病机制、探索新的有效干预措施提供新的思路。方法:体外采用MSP检测Der p2刺激下BEAS-2B细胞Slit2基因启动子甲基化水平的变化情况;复制哮喘小鼠模型采用免疫组化观察哮喘小鼠气道上皮细胞DNA甲基化转移酶蛋白表达情况;采用DNMT抑制剂5-Aza-CdR在体干预DNA甲基化水平,观察其对哮喘小鼠肺组织病理的影响,免疫组化检测5-Aza-CdR干预下Slit2基因表达的变化;采用简化甲基化测序（RRBS）分析哮喘及5-Aza-CdR干预对小鼠肺组织甲基化水平的影响,寻找差异甲基化区域（DMRs）,分析其在哮喘发病中的作用。结果:Der p2刺激下BEAS-2B细胞Slit2基因启动子甲基化程度增加;在哮喘小鼠中,气道上皮细胞DNMT1表达增加,DNMT抑制剂5-Aza-CdR有效干预哮喘组小鼠肺泡及气管壁周围细胞浸润、减少了气道上皮脱落现象,5-Aza-CdR干预后哮喘小鼠杯状细胞化生减轻,BALF中嗜酸性粒细胞显著减少,气道上皮细胞Slit2基因异常下调表达被逆转。RRBS结果显示哮喘组与对照组间基因组有1216个DMRs;其中932个DMRs甲基化升高,284个甲基化程度降低。而与哮喘组相比,5-Aza-CdR干预后,全基因组有925个DMRs有显著性差异,其中772个DMRs甲基化水平降低,153个甲基化水平升高。全基因组不同元件的平均甲基化水平在不同区域有所差别,但在各区域内,哮喘组DNA甲基化水平高于正常对照组,而5-Aza-CdR能抑制哮喘环境下这种异常的甲基化修饰。Cp G岛（CGI）及其附近区域平均甲基化水也呈现相同变化趋势。生物信息学分析发现,5-Aza-CdR对哮喘小鼠肺组织甲基化状态调控的基因在细胞内的分布主要集中在细胞骨架、细胞连接等方面。进一步分析正常对照组、哮喘组、5-Aza-CdR干预组三组间DMRs,我们发现哮喘小鼠肺组织AES在81564308-81564377区甲基化显著高于正常对照组,而5-Aza-CdR显著抑制了这种异常甲基化增加现象。免疫组化结果显示哮喘小鼠气道上皮细胞中AES蛋白表达水平低于正常对照组,提示哮喘小鼠气道上皮细胞AES蛋白的下调表达受DNA甲基化增加调控,推测AES异常甲基化参与哮喘气道上皮异常损伤修复。结论:气道上皮细胞Slit2基因启动子存在甲基化现象,而哮喘环境下Slit2基因内这一位点的甲基化水平增加;在体正常情况下气道上皮细胞DNTM1本底表达水平低,而哮喘时DNMT1表达显著增加;DNMT1甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR能抑制哮喘引起的Slit2基因的下调表达,与哮喘组相比,5-Aza-CdR药物干预组气道上皮细胞Slit2表达显著增加。DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR能有效逆转OVA引起的小鼠肺病理损伤,降低哮喘状态下气道上皮粘液分泌水平。本部分研究结果为探索哮喘气道重塑尤其是气道上皮细胞对哮喘环境的应答、深入剖析气道上皮在哮喘发生、发展过程中的地位和作用提供实验依据。第三部分外源性Slit2-N在哮喘气道上皮细胞EMT转化中的作用目的:探讨外源性Slit2-N对TGF-β1诱导的气道上皮细胞BEAS-2B细胞EMT的干预,为哮喘气道重塑的早期干预提供新的思路。方法:体外采用TGF-β1刺激人气道上皮细胞BEAS-2B,以外源性Slit2-N干预,光学显微镜下观察细胞形态变化;Western blot检测间质化标志物变化情况,免疫荧光观察上皮、间质细胞标志蛋白表达水平;采用划痕法观察细胞迁移能力的变化,免疫荧光染色观察细胞骨架重排情况。结果:体外,与正常对照组细胞相比,TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞形成了更加细长、肥大的间质形态学特征,而外源性Slit2-N明显抑制了TGF-β1诱导的细胞形态学变化。TGF-β1上调BEAS-2B细胞间质标志物β-catenin和SM-α-actin的表达,而Slit2-N预处理能剂量依赖性地下调这两种蛋白质表达水平。在上皮和间质marker双染时,未处理的对照BEAS-2B细胞高表达Cytokeratin 5,但vimentin表达量很低,而TGF-β1诱导BEAS-2B细胞中Cytokeratin 5表达下调、vimentin表达大量增加,提示TGF-β1刺激下BEAS-2B细胞倾向于向具有典型的间充质特征方向转化。用100ng/ml Slit2-N预处理能抑制TGF-β1诱导的上皮标记Cytokeratin 5的下调和间充质标记vimentin的上调,抑制细胞迁移能力。在未处理的对照组细胞内,F-肌动蛋白主要分布的胞膜皮质部分,TGF-β1引起皮层F-肌动蛋白重新排列成应力纤维模式,在整个细胞内以纤维状均匀分布,而外源性Slit2-N预处理大幅度减少了F-肌动蛋白的重排。结论:外源性Slit2-N能抑制TGF-β1诱导的气道上皮细胞EMT,减少间质标志性蛋白的生成;通过抑制细胞骨架重排,抑制TGF-β1刺激下细胞的迁移,为哮喘临床早期防治提供了一种新的思路。