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目的:糖尿病病人易患结直肠癌,国外流行病学调查发现,糖尿病人群患结直肠癌的风险较非糖尿病人群明显增加。VEGF作为最重要的血管生成调节因子,在肿瘤血管新生以至对肿瘤的发生发展有重要作用。同时,VEGF又是一种免疫抑制分子,在介导肿瘤免疫抑制以至对肿瘤发生发展也有重要作用。糖尿病患者血清中VEGF的含量较非糖尿病患者增高,尤以伴发微血管并发症者增高明显,且与患者血浆葡萄糖和胰岛素浓度关系密切。血浆葡萄糖和胰岛素浓度的变化,在糖尿病的发病过程中有明显的阶段性。本研究模拟糖尿病病程中葡萄糖和胰岛素浓度的变化,观察不同浓度葡萄糖、不同浓度胰岛素以及不同浓度葡萄糖和胰岛素联合作用对Colon26肿瘤细胞分泌VEGF的影响,为探讨葡萄糖和胰岛素浓度的变化与糖尿病患者结直肠癌发生、发展的关系提供实验和理论依据。方法:体外常规培养Colon26肿瘤细胞,根据所用培养液含葡萄糖、胰岛素浓度的不同,实验所用细胞共分12组,A组:细胞培养液含10%新生牛血清的RPMI1640培养液(对照组);B组含10%新生牛血清的RPMI1640+5mmol /L葡萄糖;C组含10%新生牛血清的RPMI1640+10mmol /L葡萄糖;D组含10%新生牛血清的RPMI1640+25mmol /L葡萄糖;E组含10%新生牛血清的RPMI1640+5uIU/mL胰岛素;F组含10%新生牛血清的RPMI1640+25uIU/mL胰岛素;G组含10%新生牛血清的RPMI1640+125uIU/mL胰岛素;H组含10 %新生牛血清的RPMI1640+5mmol/L葡萄糖+5uIU/mL胰岛素; K组含10 %新生牛血清的RPMI1640+5mmol/L葡萄糖+125uIU/mL胰岛素;L组含10%新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖+125uIU/mL胰岛素;M组含10%新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖+5uIu/mL胰岛素; N组含10 %新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖+1.25uIU/mL胰岛素。每组设3个复孔,培养48小时后收集培养液上清,用ELISA法测VEGF的浓度;同时收集细胞抽提总RNA, RT-PCR同时扩增目的片段VEGF和内参照β-actin,琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统上扫描分析,计算VEGF mRNA相对表达量。整个实验过程重复三次。统计学分析采用单因素方差分析和t检验,p<0.05有统计学意义。结果:1不同浓度的葡萄糖对Colon26肿瘤细胞培养上清VEGF分泌的影响。B、C、D组(培养液含有5mmo1/L的葡萄糖,10mmo1/L的葡萄糖,25mmo1/L的葡萄糖)的VEGF浓度(9.4167±0.4646,9.4667±0.1528,9.6167±0.2887)与A组(对照组)的VEGF浓度(9.5583±0.2691)相比无显著性差别(P>0.05)。2不同浓度的胰岛素对Colon26肿瘤细胞培养上清VEGF分泌的影响。G组(培养液含有125uIU/mL的胰岛素)的VEGF浓度(27.7667±0.2517)明显高于A组(对照组)、E组、F组(培养液分别含有5uIU/mL,25uIU/mL的胰岛素)的VEGF浓度(9.5583±0.2691,9.5833士0.0764,9.6167士0.1258),差异有显著性(P<0.01 ),而A组、E组与F组之间无差异。3不同浓度的葡萄糖、胰岛素对Colon26肿瘤细胞培养上清VEGF分泌的影响。K、L组(培养液均含有125 uIU/mL胰岛素)的VEGF浓度(27.8333±0.3512,27.6000±0.6557)均明显高于A组的VEGF浓度(9.5583±0.2691),差异有显著性(P<0.01),而K、L组组间无差异。H、M、N组(培养液分别含有5 uIU/mL ,5uIU/mL,1.25 uIU/mL的胰岛素)的VEGF浓度(9.7167±0.00289,9.8667±0.0577,9.90±0.1732)与A组相比无显著性差别(P>0.05)。4 VEGF mRNA的表达水平与上清中VEGF的分泌水平一致。经过琼脂糖凝胶电泳扩增产物,紫外透射仪下观察并拍照,同时用计算机软件进行图像灰度扫描半定量分析。可以看到G、K、L组(培养液含有125uIU/mL的胰岛素)的VEGF mRNA电泳条带与A组(对照组)的VEGF mRNA的电泳条带相比明显增粗变亮,VEGF mRNA的表达水平(0.8802±0.19;0.8605±0.18;0.8569±0.22)与A组(对照组)VEGF mRNA的表达水平(0.4653±0.02)相比有统计学意义(P<0.05)。而其他组与对照组相比电泳条带在宽度和亮度上没有差异,VEGF mRNA的表达水平与对照组相比亦无统计学意义(P>0.05)。提示高浓度胰岛素是在转录水平影响Colon26肿瘤细胞分泌VEGF。结论:葡萄糖浓度不影响Colon26肿瘤细胞分泌VEGF。胰岛素浓度对Colon26肿瘤细胞分泌VEGF的影响表现为只有在高浓度时才引起培养液上清中VEGF的分泌增加,同时高浓度胰岛素使VEGF mRNA表达增多,说明高浓度胰岛素是在转录水平促进其分泌的。