传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)侵染相关蛋白的研究

来源 :中山大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:gy19910192
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传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)是虹彩病毒科肿大细胞病毒属的代表种。肿大细胞病毒属病毒是引起亚洲淡水养殖鱼类死亡的主要病原,并对亚洲淡水鱼类养殖业特别是对我国鳜鱼养殖业造成巨大的经济损失。本文通过pull down和免疫共沉淀技术鉴定ISKNV的主要衣壳蛋白(MCP)与鳜caveolin-1蛋白(mCav-1)之间存在蛋白-蛋白相互作用。通过体内和体外实验证明MCP与mCav-1蛋白之间的相互作用不依赖于典型的caveolin-1的脚手架区域(CSD)。免疫荧光共聚焦结果表明,在ISKNV感染鳜鱼仔鱼细胞(MFF-1)0到4h内,MCP与mCav-1存在从细胞膜到细胞核的共定位现象。亚细胞分离实验的结果表明,在病毒感染的早期阶段,MCP与细胞内脂质筏之间存在共迁移现象。通过RNAi技术沉默mCav-1蛋白,结果表明敲除mCav-1基因的转录并不影响病毒对细胞的结合能力,但能显著地抑制病毒进入MFF-1细胞。上述研究表明,ISKNV的MCP与mCav-1蛋白之间存在相互作用,该作用在病毒入侵过程中发挥着重要的作用,并且mCav-1蛋白在ISKNV感染的早期阶段扮演着重要的角色。大量研究表明病原体可以利用细胞的内吞作用和细胞质的运输机制来感染宿主细胞。了解微生物如何利用细胞的功能来感染细胞,能够使我们更加明确病原体的基本生物功能。先前的研究结果表明,ISKNV通过caveolae依赖的内吞途径感染MFF-1细胞,并且诺考达唑(nocodazole)能够抑制ISKNV侵入MFF-1细胞。本文中,我们通过使用各种化学药物细胞松弛素B (cytochalasin B)、细胞松弛素D(cytochalasin D)、诺考达唑和latrunculin A深入探讨微管和微丝在ISKNV感染MFF-1细胞过程中的作用。结果表明,细胞松弛素B、细胞松弛素D和latrunculin A能够抑制ISKNV对MFF-1细胞的感染。进一步研究发现actin解聚药物处理MFF-1细胞不影响病毒与细胞的结合,但是却显著减少病毒的内吞作用。实时定量PCR结果表明,细胞松弛素B,、细胞松弛素D和诺考达唑能够显著抑制ISKNV晚期的复制。另外,我们发现ISKNV的MCP与MFF-1细胞的actin蛋白之间存在相互作用,纯化的ISKNV病毒粒子中包含有actin蛋白,并且actin位于病毒的内部。上述研究结果表明,ISKNV的入侵和晚期复制过程中需要利用MFF-1细胞的细胞骨架运输系统。该研究有助于我们更好的理解细胞骨架在病毒感染过程中的作用以及虹彩病毒如何利用细胞骨架来促进对细胞的感染。
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