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研究背景和目的膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤之一,通常以尿路上皮癌最为常见,占膀胱癌90%以上。膀胱癌的发病率和死亡率高且呈逐年上升趋势,严重威胁人们的健康。尽管近年来膀胱癌在诊断和治疗方面取得了极大进展,但治疗后5年生存率仍不理想,尤其是转移性膀胱癌,生存率更低。膀胱癌的侵袭转移和高复发率是影响膀胱癌患者治疗和预后的重要因素,鉴别高侵袭性膀胱癌及明确膀胱癌的发病机制对膀胱癌患者的早期诊断、手术方案以及个体化治疗的选择具有重要意义。目前关于膀胱癌侵袭转移的相关分子机制还不完全清楚。因此,深入研究膀胱癌侵袭转移的分子生物学机制有助于探寻膀胱癌诊断、治疗和预后的新型靶标,对膀胱癌早期诊断、治疗及提高患者生存率具有重要意义。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1（SPARCL1,secreted protein acidic and rich in cysteines-like protein 1）,是一种细胞外多功能基质糖蛋白,参与了细胞黏附、增殖和迁移调控等多种生物学功能。SPARCL1在绝大多数肿瘤细胞中表达下调,并参与了多种肿瘤的发生、发展、转移和预后。然而对于SPARCL1在膀胱癌中的研究目前未见详细报道,SPARCL1在膀胱癌发生发展中的作用机制尚不明确。因此,本课题拟通过研究SPARCL1在膀胱癌组织及配对癌旁组织中的差异表达量,分析SPARCL1表达与膀胱癌患者临床疾病特征及预后的相关性;研究SPARCL1对膀胱癌细胞生物学行为的影响;探讨SPARCL1在膀胱癌发生发展中的作用及分子机制,为SPARCL1成为膀胱癌诊断、治疗及预后的新靶标提供理论依据。方法1.分析Oncomine数据库中多种肿瘤中的SPARCL1表达情况。检索GEPIA和TCGA数据库内不同膀胱癌数据进一步探讨SPARCL1在膀胱癌中的表达情况。2.运用q RT-PCR检测22例膀胱癌组织及配对癌旁组织中SPARCL1的差异表达情况;通过q RT-PCR及Western blot检测4株膀胱癌细胞（T24、5637、UMUC-3、SW780）及人尿路上皮细胞株SV-HUC-1内SPARCL1的m RNA及蛋白表达水平。3.通过免疫组化染色分析含有68例膀胱癌及40例配对癌旁组织芯片中SPARCL1蛋白表达量,进一步分析SPARCL1与临床相关病理参数之间的关系。通过对TCGA公共数据库中膀胱癌数据集挖掘,选取Bladder Cancer（MSK/TCGA,2020）数据集探寻SPARCL1表达量与膀胱癌预后的关系。4.构建过表达SPARCL1慢病毒,转染内源性SPARCL1低表达的T24及5637细胞,建立稳定过表达Lv-SPARCL1的细胞株。通过CCK8、流式细胞术和Transwell迁移侵袭等实验方法分析过表达SPARCL1后T24及5637细胞在增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭等细胞生物学行为方面的改变,并通过q RT-PCR检测MMP7、MMP13表达量的变化。构建敲减SPARCL1慢病毒,转染UMUC-3细胞,Transwell实验分析敲减SPARCL1后UMUC-3细胞迁移和侵袭的改变及MMP7、MMP13表达水平的变化。5.SPARCL1在膀胱癌中的作用机制初探:对SPARCL1过表达组与对照组细胞进行RNA-seq,通过测序数据分析过表达前后差异基因及通路富集,初步研究SPARCL1参与膀胱癌发生发展的分子生物学机制。6.通过q RT-PCR及Western blot对测序分析数据验证:检测过表达SPARCL1后T24及5637细胞EMT标志物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）和相关转录因子Snail的变化,以及PI3K/AKT信号通路中相关蛋白表达变化。7.建立裸鼠移植瘤模型,利用免疫组化方法检测过表达SPARCL1的移植瘤体中EMT标志物表达变化。结果1.分析Oncomine数据库结果显示,20余种肿瘤中SPARCL1均有异常表达,膀胱癌中SPARCL1表达下调。进一步对GEPIA和TCGA数据库内的膀胱癌数据分析发现,与癌旁组织相比,膀胱癌组织内的SPARCL1表达下降,差异显著。2.q RT-PCR结果显示,与配对癌旁组织相比,22例膀胱癌组织中SPARCL1表达量明显下调;4株膀胱癌（T24、5637、UMUC-3、SW780）细胞内SPARCL1的m RNA及蛋白表达量均低于人尿路上皮细胞SV-HUC-1,差异显著。3.68例膀胱癌组织芯片的免疫组化染色结果显示,SPARCL1在膀胱癌中的表达水平显著低于癌旁组织。SPARCL1的表达量与患者年龄、性别及肿瘤大小无显著相关性,但与患者AJCC分期和淋巴转移显著相关。对TCGA数据库内膀胱癌数据集Bladder Cancer（MSK/TCGA,2020）进行单因素生存分析,结果表明SPARCL1低表达的膀胱癌患者总生存时间显著高于SPARCL1高表达的患者,提示SPARCL1与膀胱癌预后密切相关。多因素生存分析显示淋巴结转移、远处转移与膀胱癌预后相关,可作为膀胱癌的独立预后因素。4.成功构建SPARCL1过表达慢病毒,转染内源性SPARCL1低表达的膀胱癌细胞T24和5637后抑制了细胞的迁移、侵袭能力,但对增殖、细胞周期与凋亡无明显作用,SPARCL1过表达后MMP7和MMP13表达下调。构建SPARCL1敲减慢病毒,转染内源性SPARCL1高表达的UMUC-3细胞,SPARCL1表达降低后UMUC-3细胞的迁移和侵袭能力显著增强,MMP7和MMP13表达相应上调。5.数据库分析发现膀胱癌中SPARCL1 DNA启动子区存在高度甲基化,对T24和5637细胞进行不同浓度DNA甲基转移酶抑制剂DAC处理后,SPARCL1的表达部分恢复,差异显著,提示DNA启动子区高甲基化是SPARCL1在膀胱癌中低表达的原因之一。6.基于高通量转录组测序技术,寻找过表达SPARCL1后T24细胞系的差异表达基因,对差异基因进行Gene Ontology分析,显示伤口愈合（wound healing）、细胞外基质（Extracellular）、胶原蛋白的结合（Collagen binding）等与肿瘤相关的GO分类明显改变,提示SPARCL1可能通过细胞外基质参与膀胱癌发生发展的关键过程。KEGG通路分析显示,SPARCL1可能参与了PI3K/AKT信号途径调控。7.测序数据验证结果显示,过表达SPARCL1后细胞上皮标志物E-cadherin表达升高,间质标志物N-cadherin和Vimentin表达降低,细胞呈现出EMT抑制状态;过表达SPARCL1可抑制EMT相关转录因子Snail的表达。Westernblot检测结果显示过表达组p-PI3K、p-AKT蛋白显著升高。8.荷瘤动物试验发现,过表达SPARCL1前后移植瘤的生长速度及大小无显著差异。动物瘤体组织免疫组化染色结果显示,实验组瘤体中SPARCL1和E-cadherin的表达较对照组明显增高,而N-cadherin、Vimentin以及Snail表达相对减弱。结论SPARCL1在膀胱癌组织中的表达显著低于癌旁组织,且与膀胱癌患者AJCC分期和淋巴转移及预后显著相关,提示SPARCL1可以作为膀胱癌疾病诊断、进展及预后的一个新型生物标志物。膀胱癌细胞中过表达SPARCL1可导致MMP7和MMP13表达下调,进而抑制膀胱癌细胞的侵袭转移能力;SPARCL1过表达可抑制EMT的发生;进一步分析提示SPARCL1可能通过PI3K/AKT信号途径抑制EMT的发生。