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胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)是转化生长因子(TGF-β)家族中的一员。大量研究表明,GDNF对多巴胺能(DA)细胞具有营养和保护作用,最有希望成为治疗帕金森病(PD)的有效手段。但由于GDNF是一种大分子蛋白,难以通过血脑屏障,所以GDNF需直接导入脑组织或脑室。直接导入的方法对GDNF在脑中的长期存在和作用有很大的局限性,因此为了获得持续稳定的脑内表达,利用病毒载体实施GDNF基因治疗得到广泛关注,GDNF持续性、高浓度的过表达会引发一定的副作用,因此开发一个可调控性的载体系统,既能使其在体内高效稳定地发挥作用,又能将不良反应降低到最低程度是未来研究的努力方向。目前国内外还没有应用可调控的exvivoGDNF基因转运系统在PD动物模型上的成功报道。 在前期研究工作中,本实验室利用双慢病毒载体构建了Tet-On系统,一个是携带四环素应答启动子元件(TRE)和人类GDNF(hGDNF)及人源化的绿色荧光蛋白(hrGFP)两种基因的慢病毒载体,另一个是携带巨细胞病毒早期瞬时启动子(CMV-IE)和四环素调控的反式激活因子(rtTA)2S-M2基因的慢病毒载体,在诱导剂强力霉素(Dox)存在条件下,hGDNF和hrGFP同时表达。 本研究内容为: 1)将双慢病毒载体感染入骨髓间充质干细胞(hMSCs)和Hela细胞,FCM方法检测hrGFP的表达与Dox是否呈剂量依赖性; 2)利用FCM、ELISA、qRT-PCR从蛋白表达和转录水平上对exvivohGDNF/hrGFP基因转运系统的开关(On或Off)性能进行评估; 3)观察hMSCs+Dox条件培养基对6-OHDA作用的SH-SY5Y细胞的保护作用; 4)无血清培养的原代DA神经元上进一步检测hMSCs+Dox条件培养基的神经保护功能。以期为可调控性的exvivoGDNF基因转运系统应用于临床治疗PD及其它神经退行性疾病,奠定坚实的理论基础。 实验结果: 1.hrGFP的表达与Dox呈剂量依赖性。双Tet-On慢病毒载体感染的Hela细胞和hMSCs,Dox在10-4-104ng/ml的剂量范围内,hrGFP的平均荧光强度(MFI)与Dox呈剂量依赖性。 2.在蛋白表达水平上,可调控性慢病毒载体能够紧密调控转基因的表达,并且在不含Dox时漏表达效率非常低。“On-Off”组,Dox诱导(On)4d后,大部分hMSCs表达hrGFP,撤去Dox(Off)3d后,仍有大量hrGFP+细胞存在,撤去Dox(Off)6d后,只能观察到极少数hrGFP+细胞。“Off-On”组,不含Dox(Off)的培养基培养病毒感染的hMSCs4d后,观察不到hrGFP+细胞;当在培养基中加入Dox培养3d后,大部分细胞表达hrGFP,继续培养3d,hrGFP+细胞率几乎不变。在“On-Off”组,感染的hMSCs经Dox诱导4d后,hrGFP的MFI为2495.56±186.01。在第7d、10d、14d(即撤去Dox的3d、6d、10d),hrGFP的MFI分别减少到1563.53±321.47、187.79±73.47、4.43±0.37。在“Off-On”组,不含Dox(Off)的培养基培养4d,检测不到hrGFP,在第7d、10d、14d(即加Dox的3d、6d、10d),MFI分别增加到2508.12±257.68、1987.16土306.37、2106.23±194.43。Dox诱导10d、14d时,hrGFP在感染的hMSCs表达水平降低。hGDNFELISA检测结果表明,“On-Off”组,Dox干预4d时,hGDNF的浓度为48.32±7.21pg/104cells/h,撤去Dox后,在第7d、10d、14d分别下降为46.68±4.43,6.71±2.51,1.31±0.97。“Off-On”组,在不含Dox的培养基中培养4d时,检测不到hGDNF,当Dox作用3d、7d、10d时,hGDNF浓度分别提高到51.11±5.81、45.13±2.06、50.77±6.41。 3.在转录水平上,可调控性慢病毒载体能够紧密开关(On或Off)调控转基因的表达。病毒感染的hMSCs,Dox干预7d时,hGDNFmRNA和hrGFPmRNA水平分别是Dox不存在时的103倍和120倍。 4.病毒感染的hMSCs仍具有分化为脂肪细胞和成骨细胞的干细胞特性。 5.Dox干预7d时,病毒感染的hMSCs大量表达hrGFP,hrGFP+细胞率为50.07±2.76%。 6.hMSCsG/G+Dox条件培养基中hGDNF水平显著高于hMSCsG/G-Dox条件培养基。hGDNFELISA检测hMSC、hMSCsG/G-Dox、hMSCsG/G+Dox三种条件培养基中hGDNF的浓度分别为0、0.129±0.002、93.487±2.826(ng/ml)。 7.病毒感染的hMSCs,经Dox诱导后分泌的hGDNF蛋白能够促进SH-SY5Y细胞的增殖,并能保护SH-SY5Y细胞抵抗6-OHDA诱导的死亡。hMSCsG/G+Dox条件培养基稀释比例为1∶8、1∶16、1∶32时能够提高SH-SY5Y细胞的存活力;与6-OHDA单独作用组相比,hMSCsG/G+Dox条件培养基以1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀释,并与6-OHDA共同作用于SH-SY5Y,能够显著提高细胞存活率。在6-OHDA存在时,1∶8稀释的hMSCsG/G+Dox条件培养基与GDNF蛋白组比较,能够提高SH-SY5Y的细胞存活率,并且两者无显著差异。相反,Dox、hMSCs和hMSCsG/G-Dox条件培养基不能够保护SH-SY5Y细胞抵抗6-OHDA诱导的细胞死亡。 8.hMSCsG/G+Dox条件培养基对原代多巴胺能神经元具有保护作用。与hMSCs、hMSCsG/G-Dox、Dox、对照组相比,hMSCsG/G+Dox条件培养基和同等浓度的hGDNF能够增加TH+神经元胞体面积、突起数量、突起分枝点、TH+神经元比例。 结论: 当Dox存在时,可调控性慢病毒感染的hMSCs能够高效表达hGDNF和hrGFP;Dox不存在时,转基因的漏表达效率很低;病毒感染的hMSCs仍具有干细胞特性;病毒感染并经Dox诱导的hMSCs分泌的hGDNF能够保护SH-SY5Y细胞抵抗6-OHDA诱导的死亡,并能促进体外培养的中脑腹侧DA神经元的存活。