论文部分内容阅读
肺炎链球菌是一种条件性致病的革兰氏阳性胞外菌,常定殖在人上呼吸道器官黏膜,主要侵害的对象是免疫力低下的人群,例如儿童和老年人,感染后会引起肺炎、脑膜炎、中耳炎等侵袭性疾病。肺炎链球菌溶血素（Pneumolysin,PLY）是肺炎链球菌重要的毒力因子,在肺炎链球菌致病中发挥重要作用,可诱导宿主免疫应答,参与引起IL-1β、IL-18等细胞因子的分泌。炎症小体是一种细胞胞浆中的多蛋白聚合物,主要由模式识别受体、凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）以及caspase-1前体组成。越来越多的研究表明炎症小体在先天免疫中发挥重要作用,通过调节IL-1β细胞因子的分泌,参与机体抗菌感染免疫。本课题组前期研究发现:在肺炎链球菌感染巨噬细胞过程中PLY参与诱导NLRP3、AIM2炎症小体的组装,通过活化caspase-1进而引起IL-1β的成熟与分泌;NLRP3、ASC缺失会损伤宿主对肺炎链球菌的免疫防御。但在肺炎链球菌感染宿主过程中,AIM2炎症小体的作用尚不清楚,肺炎链球菌感染诱导炎症小体活化的具体机制也待进一步探索。本试验以AIM2缺失小鼠(AIM2-/-)与野生型小鼠（Wild type,WT）为研究对象,通过体内外感染试验研究AIM2炎症小体在肺炎链球菌感染防御中的作用及肺炎链球菌诱导炎症小体激活的机制。1.AIM2在肺炎链球菌感染防御中的作用研究用5×107 CFU肺炎链球菌野生型菌株D39滴鼻感染AIM2-/-小鼠和WT小鼠,比较两种小鼠在感染后的生存情况。在感染肺炎链球菌后48 h收集小鼠的肺脏匀浆、涂板计数,了解两种小鼠体内细菌定殖量的差异;同时,采集肺脏组织制作切片染色,观察肺脏组织病理变化情况。为了进一步探究AIM2缺失对于宿主感染肺炎链球菌后体内细胞因子分泌量的影响,在感染12 h后收集支气管肺泡灌洗液,ELISA检测细胞因子的分泌量。结果显示:感染14天内与WT小鼠相比,AIM2-/-小鼠的死亡率（50%,7/14）更高,而WT小鼠的死亡率为18.75%（3/16）;AIM2-/-小鼠肺脏细菌定殖量为WT小鼠的10倍,两种小鼠细菌定殖量差异显著;与WT小鼠相比,AIM2-/-小鼠肺部炎症反应加重,表现为更为明显的炎性细胞浸润、间质增生等;AIM2-/-小鼠肺泡灌洗液中IL-1β的分泌量显著低于WT小鼠,而IL-12、IL-6和TNFα的分泌量无显著性差异。以上试验结果表明:AIM2参与宿主抗肺炎链球菌感染,AIM2的缺失会提高宿主对于肺炎链球菌感染的易感性,机体表现为更高的死亡率、更高的细菌定殖量、更严重的肺部炎症反应。2.AIM2炎症小体在肺炎链球菌感染巨噬细胞诱导IL-1β成熟与分泌中的作用研究用D39感染WT小鼠腹腔巨噬细胞,Realtime RT-PCR检测AIM2 mRNA的表达情况,发现感染肺炎链球菌后AIM2的表达量明显上调。而后用D39分别感染AIM2-/-、WT小鼠腹腔巨噬细胞,通过ELISA、Western blot检测IL-1β以及caspase-1的分泌以及前体形式、成熟形式蛋白表达水平,发现在感染D39后与WT巨噬细胞相比,AIM2-/-巨噬细胞中IL-1β分泌水平、caspase-1的活化片段显著降低。为进一步探究胞内钾离子外流对于肺炎链球菌感染巨噬细胞中AIM2炎症小体活化的影响,在用D39感染WT小鼠与AIM2-/-小鼠腹腔巨噬细胞时,向培养体系中加入不同浓度的KCl以阻断钾离子外流,ELISA检测培养上清中IL-1β、TNFα的分泌水平,Western blot检测caspase-1活化情况,并在经由化学交联处理后检测ASC的寡聚化情况,试验结果显示,随着胞外钾离子浓度的升高,IL-1β分泌水平、caspase-1活化以及ASC寡聚化明显降低,且与WT巨噬细胞相比AIM2-/-巨噬细胞中ASC的聚集情况明显降低。上述结果表明,在肺炎链球菌感染巨噬细胞过程中AIM2炎症小体参与调节IL-1β的成熟与分泌,胞内钾离子的外流对于炎症小体的活化有重要作用。3.肺炎链球菌感染巨噬细胞诱导炎症小体活化机制研究为确定细胞通路在肺炎链球菌感染巨噬细胞诱导炎症小体活化中的作用,在肺炎链球菌感染巨噬细胞模型中,使用脾酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase,Syk）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）等通路的抑制剂预处理细胞后D39进行感染,ELISA检测IL-1β分泌量的差异,同时通过Western blot检测相关蛋白水平。结果显示与DMSO处理组相比巨噬细胞在用Syk通路抑制剂（R406）以及JNK通路抑制剂（SP600125）预处理后IL-1β分泌水平降低,caspase-1活化以及ASC寡聚化减弱。表明:Syk、JNK参与调节肺炎链球菌感染巨噬细胞过程中炎症小体的活化。为了探索PLY在肺炎链球菌感染巨噬细胞诱导炎症小体激活中的作用,用D39及PLY缺失的Δply菌株分别感染WT小鼠腹腔巨噬细胞,Western blot检测感染后不同时间点Syk、JNK的磷酸化情况。结果显示,D39感染巨噬细胞30 min内Syk、JNK出现明显的磷酸化,而Δply并不能引起Syk、JNK的活化。为进一步确定其中PLY的作用,用不同浓度的PLY重组蛋白（rPLY）处理巨噬细胞,Western blot检测蛋白磷酸化情况。实验结果显示,随着处理巨噬细胞rPLY浓度的升高,Syk、JNK磷酸化程度增强。而肺炎链球菌感染诱导的JNK磷酸化经由Syk抑制剂处理后会明显降低。以上试验结果表明:PLY通过介导Syk、JNK的磷酸化参与调节肺炎链球菌感染诱导的炎症小体激活,在此过程中Syk可能在JNK上游发挥作用,调控炎症反应的进程。