适用于低光子数情形的荧光寿命分析方法研究

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荧光寿命显微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)利用荧光寿命能灵敏反映荧光团相互作用及微环境变化的特点进行成像,且弥补了荧光强度成像一般难以实现定量测量的缺点,被广泛应用于细胞微环境参数测量和蛋白质相互作用等生物医学研究,已逐渐成为现代生物学和生物医学研究中频繁使用的一种分析工具。目前,采用时间相关单光子计数(time correlated single photon counting,TCSPC)法进行荧光寿命探测的时域FLIM技术因其发展时间长、成熟稳定,且灵敏度和分辨率均较高而得到了广泛使用。在TCSPC-FLIM中,如何从测量得到的光子计数数据中获得准确寿命值是一个非常关键的环节。TCSPC的测量再现了荧光衰减的过程,将荧光衰减曲线转化为光子计数随时间变化的直方图,对于大部分荧光寿命分析算法而言,测量的光子数越少,分析得到的寿命值偏差就越大,反之光子数越多,分析则越准确,但是系统采集光子数越多,一般就意味着采集时间越长,从而限制了成像速度并延长了样品的光照时间,不利于活细胞样品的实时监测。因此,从荧光寿命分析算法着手,发展适用于低光子数情形的荧光寿命分析算法,对发展快速FLIM成像方法及其应用都具有重要的意义。目前广泛使用的荧光寿命分析算法有非线性最小二乘拟合法、最大似然估计法等,这些方法大部分都不能在低光子数情形下分析得到准确的荧光寿命值。本论文将TCSPC-FLIM的荧光寿命分析看成一个稀疏逆问题,提出一种新的基于交替下降条件梯度(alternating descent conditional gradient,ADCG)的荧光寿命分析算法ADCG-FLIM,旨在提高低光子数情形的寿命分析准确度和精度。本论文的研究工作包括:1.构建TCSPC-FLIM探测模型,并将实际成像过程中的脉冲激发周期效应和光子探测的泊松噪声以及潜在的背景噪声均容纳进模型中,使探测模型更接近于真实情况。2.将荧光寿命分析转化为稀疏逆问题,建立ADCG-FLIM的优化模型,利用ADCG算法框架进行求解,将优化问题中的不同待求变量(如总光子数、寿命、背景噪声)进行独立的坐标下降,直至最终收敛。利用该算法对模拟数据和实验数据进行分析,并与其它多种现有寿命算法的分析结果进行比较,表明ADCG-FLIM能够更为精确地分析出低光子数衰减数据的寿命值。3.将ADCG-FLIM进一步扩展,对荧光衰减呈现双指数衰减规律的情形(即双组分寿命情形)进行分析。通过对模拟数据的计算和分析,证明扩展之后的ADCG-FLIM能够稳定地实现各寿命组分占比的定量分析,从而在定量分析蛋白质相互作用、细胞能量代谢状态测量等研究中有很好的应用前景。本论文工作的创新点包括:1.提出一种新的荧光寿命分析算法ADCG-FLIM,在TCSPC-FLIM的低光子数和低信噪比的衰减数据情形下也能较准确地分析出寿命。2.进一步扩展ADCG-FLIM实现已知寿命值的双组分占比定量分析,有望为快速FLIM分析提供新的分析手段。
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