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光学显微成像可提供高对比的图像对众多科学领域都有重大贡献,尤其是对生物医学领域,因其具有非侵入性等优点受到生物学家和医学家的欢迎,而在生物医学诊断与治疗中发挥巨大作用。在过去十年里,随着超分辨显微镜的出现,光学显微镜的最后一个阻碍——衍射极限被克服,且成像分辨率能高达20 nm。根据其“绕过”光学衍射极限的不同技术手段,主要分为3种:1)通过空间光学调制缩小光斑的点扩散函数（Point Spread Functions,PSF）尺寸,如Stefan等提出的受激辐射损耗超分辨成像（Stimulated Emission Depletion Microscopy,STED）;2)基于光学频域扩展的显微成像技术,如（饱和）结构光照明显微成像（（Saturated）Structural Illumination Microscopy,SSIM/SIM）;3)基于单分子定位成像（Single Molecule Localization Microscopy,SMLM）,代表性技术包括Shroff等报道的光活化定位显微成像技术（Photoactivated localization microscopy,PALM）和Zhuang课题组开发的随机光学重构超分辨成像（Stochastically Optical Reconstruction Microscopy,STORM）,其中单分子定位超分辨成像技术主要依赖荧光分子标记生物样品后,在激光照射下产生随机的光致闪烁,结合相应重构算法获得超分辨图,该成像技术具有成像分辨率高、探针可灵活设计等特点。线粒体是细胞中十分活跃的细胞器,被认为是真核细胞的能量工厂,还维持着细胞内离子浓度平衡,为脂类、蛋白质和DNA等生物大分子合成前体,并肩负着产生和清除如氨、活性氧等潜在的破坏性代谢副产物的重任。此外,线粒体在整个信号通路和应激反应方面发挥着积极作用。线粒体是动态的,其生物学功能与其形态及分布紧密相关,包括线粒体融合与分裂、迁移等。最近研究表明,线粒体功能和功能障碍已经成为介导代谢性疾病、癌症发生、神经退行性和衰老的关键因素,揭示着线粒体如何促进健康和病变。研究线粒体的动态结构变化对深入了解其生物学功能意义重大,尤其是在传统光学显微成像无法提供高清成像的线粒体亚结构层面的超清晰成像研究,因此,超分辨率光学成像线粒体动力学对于线粒体如何促进健康和病变具有重要意义。随机光学重建显微镜（STORM）是一种很有前途的线粒体超微结构可视化技术,本硕士论文工作主要利用STORM技术研究线粒体动力学,主要内容包括以下几个方面:1.针对STORM超分辨成像的要求,设计开发出适合活细胞线粒体标记的新型闪烁荧光探针,用于活细胞的STORM超分辨成像。对新合成的分子探针进行,包括吸收和发射的光谱测试、适度激光功率激发下的光致闪烁测试、以及光稳定性等测试,并通过荧光共定位实验验证了分子探针对线粒体的选着性标记特性。2.开发了一套基于泊松噪声校正的主成分分析算法（NC-PCA）来对原始闪烁数据进行降噪,并通过K-因子算法锐化图像,对仿真数据和实验数据做预处理后利用CSSTORM算法定位,达到提高分子定位精度的目的。3.基于自主开发的染料,在实验室搭建的dSTORM系统上采集活细胞数据,通过自主开发的降噪算法进行预处理后定位可以观察到线粒体动态过程的超分辨成像。本论文的创新点如下:1.设计了一种新型的菁染料,可在不需要成像缓冲液条件下和低激光功率下自发进行原位光闪烁活化,可靶向性定位线粒体细胞外膜上,在活细胞应用中其效果优于Alexa 647;2.开发一套NC-PCA应用于STORM成像技术的算法,该方法可以对信噪比较低的单分子闪烁图像进行降噪处理,并有效提高CSSTORM算法的定位精度;3.基于新开发的染料和算法成功观察到长时程的活细胞线粒体外膜的超分辨动态。