里氏木霉因其纤维素酶产量高、产酶活力高而被广泛应用于工业生产纤维素酶,但其纤维素酶产量仍有待提高,如何进一步提高其纤维素酶产量成为目前研究的热点。大量研究表明,丝状真菌通过菌丝尖端向细胞外分泌蛋白质,据此推测:菌丝分支的增加可以产生更多的菌丝尖端,因而可以达到提高蛋白产量的目的。目前已报道影响真菌菌丝分支的基因有很多,比如ras1,ras2,rho A,spa2,cla4,cdc42和rac A等等,这些基因大都参与细胞极性的建立、胞内物质的运输等过程,对这些基因进行编辑之后观察到的结果是菌丝分支都会产生明显的变化。酿酒酵母Sec6参与细胞的胞吐作用,在细胞壁的构建和细胞极性建立等方面也起着重要作用;白色念珠菌Sec6参与细胞内物质的运输和递送,sec6基因的缺失会导致白色念珠菌菌丝分支的减少。本研究通过数据库搜索查找到里氏木霉与白色念珠菌sec6同源的基因,拟对里氏木霉sec6基因进行过表达和敲除来证实该基因对里氏木霉菌丝分支以及产酶能力的影响。本研究主要得到以下结果:(1)钙离子在一定程度上对里氏木霉的菌丝分支具有促进左右,但是不同的菌株受钙离子影响的程度不同,在4个候选里氏木霉菌株中,340554菌株受钙离子影响最大,在有钙离子和无钙离子的培养条件下,菌丝分支差异最显著,说明此菌株在不同条件下菌丝分支差异比较大,是良好的研究菌丝分支的材料,因此选择该菌株来研究里氏木霉菌丝分支相关基因。(2)在NCBI数据库中查找里氏木霉中与白色念珠菌sec6同源的基因,然后设计引物对里氏木霉340554菌株中该基因进行扩增并测序,扩增序列测序结果与NCBI数据库公布序列一致。然后对在有钙离子培养条件下sec6基因的转录水平进行测定,结果是在有钙离子条件下sec6基因的转录水平高于不含钙离子培养条件下的转录水平。(3)成功构建sec6过表达质粒,并将该质粒成功转化入里氏木霉340554菌株中,得到sec6过表达转化菌株。通过对过表达转化菌株和出发菌株各项生理生化特征对比发现:sec6过表达转化菌株菌丝生长速率较慢,测量固体培养48 h的菌落直径,和出发菌株相比,过表达转化菌株的生长速率降低了31.29%。通过对发酵5 d的酶液胞外蛋白总量进行测定,发现与出发菌株相比,胞外蛋白总量提高了14.8%。通过对sec6基因进行荧光定量检测,发现过表达转化菌株的sec6基因转录水平比出发菌株提高了31.87%。(4)通过转化得到了能够稳定遗传并表达Cas9的里氏木霉菌株,选育出的Cas9转化菌株的形态和纤维素酶活性与出发菌株相比没有明显差异,可以确保Cas9编码基因的导入和表达不会干扰其他基因的表达和功能,为里氏木霉基因功能研究提供了良好的材料;并成功构建靶向sec6基因的g RNA和d DNA质粒,可以用于sec6基因的敲除。从过表达结果来看,sec6基因确实对里氏木霉的菌丝分支和产纤维素酶能力有很大的影响,这个结果验证了本研究初期的猜想。