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乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis viruses.JEV)是黄病毒科黄病毒属的一员,其引起的乙型脑炎是一种蚊媒性的人畜共患病,具有明显的季节性和传染性。人感染JEV主要造成中枢神经系统损伤,猪感染主要引起母猪流产、公猪睾丸炎和仔猪脑炎等症状。NS1蛋白是JEV的一个非结构蛋白,参与病毒的复制、感染等过程。本研究以猪源JEV的NS1蛋白为诱饵蛋白,应用酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术从人脑组织cDNA文库中筛选、鉴定与其发生相互作用的宿主细胞互作蛋白,本研究将对阐明NS1蛋白在JEV的增殖复制机制中的作用奠定一定的基础。1、乙型脑炎病毒NS1蛋白诱饵酵母菌的构建提取猪源JEV SCYA201201株的总RNA反转录合成cDNA模板,PCR扩增NS1基因,克隆至pGBKT7载体,经PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定,成功构建诱饵质粒pGBKT7-NS1, JEV NS1基因大小为1245bp；将诱饵质粒pGBKT7-NS1转化至酵母菌Y2HGold感受态细胞,构建了JEVNS1蛋白诱饵酵母菌。运用Western blot技术从JEV NS1蛋白诱饵酵母菌的总蛋白样品检测到大小约46kDa的NS1蛋白,表明NS1基因能在诱饵酵母菌中表达。对该诱饵酵母菌进行毒性效应和自激活效应检测：诱饵酵母菌与空载对照酵母菌在SD/-Trp平板上的长势和菌落数无明显差异,表明NS1片段的插入对诱饵酵母菌无毒性作用；诱饵酵母菌与对照酵母菌在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出乳白色菌落且没有变成蓝色,在SD/-Trp/X-a-Gal/AbA平板上未见菌落,证明诱饵酵母菌无自激活效应。本研究成功构建了JEV NS1蛋白诱饵酵母菌,为进一步筛选JEV NS1蛋白相互作用的宿主蛋白提供了研究材料。2、乙型脑炎病毒NS1蛋白的宿主互作蛋白筛选运用酵母双杂交技术将JEV NS1蛋白诱饵酵母菌与人脑组织cDNA文库菌进行杂交和两轮筛选,第一轮以SD/-Trp/-Leu/X-a-Gal/AbA营养缺陷培养基平板对杂交产物进行筛选,获得72个克隆子。第二轮筛选挑取蓝色菌落克隆子,分别接种于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA营养缺陷培养基平板,并反复进行2次,共获得7个阳性克隆子。进一步对阳性克隆子利用Ampicillin抗性筛选、PCR鉴定和序列测定,获得5个阳性单克隆子；测定序列在Genbank上进行BLAST比对,5个阳性克隆分别对应α2-巨球蛋白(α2M)、人神经元性分化因子6 (NeuroD6)、DAZ associated protein 2 (DAZAP 2)、金属蛋白酶抑制剂4 (TIMP-4)和锌指蛋白251(ZNF 251)。对获得的5个阳性克隆子进行回复杂交验证实验,分别将5个阳性克隆子的文库质粒转化至Y187酵母感受态细胞构建猎物酵母菌,将猎物酵母菌与诱饵酵母菌一对一组合进行回复杂交验证,5个猎物酵母菌均为阳性结果。本研究应用酵母双杂交系统从人脑组织cDNA文库中成功筛选到了5种与JEVNS1蛋白相互作用的宿主蛋白。3、乙型脑炎病毒NS1蛋白与宿主互作蛋白相互作用的鉴定构建NS1蛋白和各宿主蛋白真核表达质粒,提取猪源乙脑SCYA201201株的总RNA并反转录合成cDNA模版,PCR扩增NS1基因序列克隆至pEGFP载体,经PCR鉴定、双酶切和测序分析,成功构建真核表达重组质粒pEGFP-NS1,插入片段大小为1245bp；提取人胚肾细胞(293细胞)的总RNA并反转录合成cDNA模板,根据Gene Bank上5个宿主蛋白的编码区序列设计合成引物并应用PCR扩增相应的基因序列,克隆至pCMV-HA载体,经PCR鉴定、双酶切和测序分析,成功构建各互作蛋白真核表达质粒,插入片段大小分别为α2M 741bp、NEUR0D6 1012bp、 DAZAP2504bp、TIMP-4672bp、ZNF251825bp。运用Western blot检测构建好的真核表达质粒在293细胞中的表达,结果显示JEV NS1蛋白与3个宿主蛋白(a2M、DAZAP2、TIMP-4)能稳定的表达。运用免疫共沉淀技术验证NS1蛋白与3个宿主蛋白在细胞内的相互作用,结果验证出蛋白DAZAP2能与NS1蛋白在细胞内发生相互作用,未能验证出α2M和TIMP-4与NS1蛋白在细胞中的相互作用。本研究使用免疫共沉淀技术验证了宿主蛋白与NS1蛋白在细胞内的相互作用,得到JEV NS1蛋白的宿主互作蛋白DAZAP2,为研究NS1蛋白在JEV的增殖复制机制中的作用奠定了一定基础。