研究背景和目的乳腺癌(breast cancer,BC)是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤,其发病率在世界范围内呈上升趋势,居妇女恶性肿瘤的首位或第2位,在西方发达国家已成为妇女的第1位死亡原因。乳腺癌转移是乳腺癌患者预后差的主要原因,有效的切断转移途径,成为临床除手术切除乳腺原发肿瘤外,提高患者生存率,延长患者生存时间,彻底根治乳腺癌的关键问题。肿瘤转移是一个多基因、多步骤、多阶段的复杂过程,目前人们虽然对肿瘤转移进行了大量的研究,但是肿瘤转移的机制仍不清楚,尤其对肿瘤转移早期事件知之甚少。血管内皮细胞生长因子受体-1(vascular endothelial growthfactor receptor-1,VEGFR-1)也称Fms相似的酪氨酸激酶(Fms-like tyrosine kinase,Fit-1),是血管内皮细胞生长因子受体的一个成员。VEGFR-1与血管内皮细胞生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、胎盘生长因子(placenta growth factor,PIGF)、血管内皮细胞生长因子-B(vascular endothelialgrowth factor-B,VEGF-B)相结合并通过其弱的酪氨酸激酶活性发挥各种生物学作用,参与缺血性疾病的血管新生、血管损伤后重塑、动脉粥样硬化、某些炎症病变以及肿瘤发生、转移等病理过程。近年来有研究发现VEGFR-1通过其弱的酪氨酸激酶活性在肿瘤的发生和转移中发生重要作用。Kaplan等报道,VEGFR-1~+CD133~+双阳性细胞即VEGFR-1~+造血祖细胞(VEGFR-1~+ hemopoietic progenitor cell,VEGFR-1~+ HPC)在肿瘤细胞到达转移灶前即可以到达特定组织器官,这些双阳性细胞聚集成团,为原发性肿瘤细胞形成一个转移位点,随后肿瘤细胞才从原发部位到达转移部位,形成转移灶。VEGFR-1~+HPC一方面吸引肿瘤细胞到达转移部位,另一方面又为肿瘤细胞到达后的定居提供更加疏松的“土壤”,有利于转移灶的形成。在随后的研究中,作者还发现,用特异性的抗VEGFR-1抗体,可以显著抑制多种肿瘤的转移。采用小鼠Lewis肺癌模型、小鼠B16黑色素瘤模型等动物肿瘤实验研究表明,VEGFR-1~+HPC充当了肿瘤转移必不可少的细胞书签(cellularbookmarking)或者说特使细胞(envoy cells)。但造血祖细胞在人体肿瘤的主要作用及机制仍不十分清楚,目前尚未在人类肿瘤模型上得到证实。本研究以乳腺癌为研究对象探讨造血祖细胞对乳腺癌转移的影响作用,主要分两部分进行,首先分离人脐带血造血祖细胞,观察体外培养条件下其对于乳腺癌细胞增殖、黏附以及侵袭能力的影响,并应用整体可视化乳腺癌肝转移模型研究裸鼠体内VEGFR-1~+HPC对乳腺癌转移能力的影响,为探讨乳腺癌转移形成机制,寻求新的抗乳腺癌靶标、阻断乳腺癌转移提供实验依据。研究内容通过细胞转染技术建立整体可视化乳腺癌高肝转移动物模型,为进一步研究VEGFR-1~+HPC在乳腺癌转移中的作用,提供良好的动物模型。通过免疫磁珠细胞分选技术分选出人脐带血CD133~+HPC,与乳腺癌细胞共培养,检测其对乳腺癌细胞增殖、黏附以及侵袭能力的影响。通过流式细胞术、免疫组织化学技术检测乳腺癌原位接种后不同时间裸鼠肝组织内VEGFR-1~+HPC含量的变化,验证VEGFR-1~+HPC在乳腺癌转移中的作用。通过免疫组织化学技术、Western blot技术检测肿瘤转移相关因子MMP-2、MMP-9等在裸鼠荷瘤不同时期含量的变化,初步探讨VEGFR-1~+HPC促进乳腺癌转移的作用机制。主要方法和结果1.整体可视化乳腺癌高肝转移动物模型的建立利用阳离子脂质体Lipofectamine(TM)~2000将pEGFP-N1质粒转染导入乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231细胞,挑选阳性克隆后筛选出稳定表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的细胞株pEGFP-MDA-MB-231细胞;通过体内连续传代的方法,建立高肝转移的乳腺癌动物模型,利用肿瘤细胞表达EGFP的特点,借助整体荧光体视镜结合IPP5.0软件采集、分析EGFP发出的荧光信号,在动物活体实时观察乳腺癌局部成瘤及转移情况;应用常规病理学方法对乳腺癌原位及转移动物模型进行评价和鉴定。结果:转染后的pEGFP-MDA-MB-231细胞稳定、高效的表达EGFP,且增殖能力与MDA-MB-231相比,差异没有显著性;pEGFP-MDA-MB-231细胞裸鼠乳房垫原位接种的成功率高达60%,组织块原位接种的成功率高达100%;第一代裸鼠肿瘤转移率较低(1/5),待肿瘤长至适合大小时,取瘤组织采用外科手术原位接种的方法将瘤组织块缝合在裸鼠乳房垫下,经体内连续传代的方法,裸鼠体内传代3次后,肿瘤肝转移能力明显增强,至接种第6周后,几乎所有的裸鼠均出现肝转移(5/5)。通过常规病理学的方法,验证了可视化高肝转移动物模型的可靠性。2.通过免疫磁珠分选技术分选出人脐带血CD133~+HPC,体外观察其对乳腺癌细胞增殖、黏附以及侵袭能力的影响取健康、新鲜的脐带血,利用人CD133免疫磁珠,采用免疫磁珠分选技术,分选出CD133~+HPC,用含20%胎牛血清的低糖DMEM培养基体外培养1～2周,与人乳腺癌MDA-MB-231细胞共同培养24 h后,采用MTT、Transwell的方法检测CD133~+HPC在体外培养条件下对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、黏附以及侵袭能力的影响。结果:免疫磁珠分选技术分选的CD133~+HPC阳性率高达80%以上,分选出的CD133~+HPC体外培养1～2周,减少诱导分化,仍保留祖细胞的特征。取培养1～2周的CD133~+HPC与乳腺癌细胞共培养24 h后,MTT法检测CD133~+HPC对乳腺癌细胞增殖能力的影响,与肿瘤细胞单独培养组比较,共培养组肿瘤细胞增殖能力显著增强,差异具有显著性(t=2.232,P=0.040)。CD133~+HPC与乳腺癌细胞共培养24 h,胰酶消化后接种于铺有FN的96孔板,进行细胞基质黏附试验。MTT法检测CD133~+HPC对乳腺癌细胞黏附能力的影响,与肿瘤细胞单独培养组相比,共培养组肿瘤细胞黏附能力显著增强,差异具有显著性(t=2.435,P=0.027)。采用Transwell小室观察CD133~+HPC对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响,与肿瘤细胞单独培养组相比,共培养组肿瘤细胞穿过基底膜的能力显著增强,差异具有显著性(F=1028.685,P=0.000)。以上实验结果说明体外培养的条件下,CD133~+HPC可以显著促进乳腺癌细胞的增殖、黏附以及侵袭能力。3.流式细胞术、免疫组织化学技术观察裸鼠肿瘤接种后不同时间VEGFR-1~+HPC量的变化在裸鼠乳腺癌原位接种前、接种后的不同时期颈椎脱臼法处死裸鼠,取裸鼠的肝组织,制成单细胞悬液后行流式细胞术(flow cytometry,FCM)检查不同荷瘤时间裸鼠肝组织内VEGFR-1~+HPC细胞含量的变化:送检FCM后,剩余的裸鼠肝、肺组织常规石蜡包埋做成蜡块,切成3μm厚的薄片,免疫组织化学染色行VEGFR-1、CD133阳性细胞的检测与分析,观察VEGFR-1、CD133在裸鼠肝组织内的定位和细胞簇形成情况,进一步验证FCM检验结果。结果:VEGFR-1~+HPC的数量随裸鼠乳腺癌原位接种的不同时间而改变,乳腺癌接种后第2周、第4周、第6周裸鼠肝组织悬液中VEGFR-1~+HPC的含量较接种前裸鼠肝组织内VEGFR.1~+HPC的含量明显增加,差异有显著性(P=0.000):肿瘤接种后,随着裸鼠荷瘤时间的延长,裸鼠肝组织内VEGFR-1~+HPC在肿瘤细胞到达肝组织前即可被检测到其含量逐渐增加,各组之间的差异具有显著性,与时间呈正相关(F=66.896,P=0.000)。说明VEGFR-1~+HPC提前肿瘤细胞到达预转移部位,随着裸鼠荷瘤时间的延长,VEGFR-1~+HPC的量逐渐增加,VEGFR-1~+HPC提前到达预转移部位,可能吸引肿瘤细胞的迁移;其含量随着荷瘤时间的延长而增加,可能为肿瘤细胞的定居提供适宜的微环境。免疫组织化学检测结果显示:VEGFR-1、CD133阳性细胞在肿瘤细胞到达肝组织前即有表达,随着裸鼠荷瘤时间的延长,阳性细胞数增加且聚集成小的细胞簇,主要分布在裸鼠肝组织的被膜下、汇管区小血管旁等部位,与肿瘤转移时肿瘤细胞最早到达形成转移瘤的部位基本一致。4.Western blot检测裸鼠肿瘤接种后不同时间肝组织内转移相关因子MMP-2、MMP-9的表达,初步探讨VEGFR-1~+HPC促进肿瘤转移的机制裸鼠组织标本送检FCM后,剩余的裸鼠取100-200 mg肝组织抽提组织总蛋白,BCA法测定蛋白浓度并分装,采用化学发光法进行Western blot检测裸鼠肿瘤接种后不同时期肝组织内MMP-2、MMP-9表达量的改变。结果:在裸鼠肿瘤接种前以及接种后的不同时间,尚未形成转移前组织内的MMP-2、MMP-9等转移相关因子随着肿瘤接种和裸鼠荷瘤时间的延长而表达量增加。初步表明MMP-2、MMP-9可能在VEGFR-1~+HPC促肿瘤转移中发挥作用,在肿瘤细胞到达转移灶前可能引起了局部微环境中的细胞及细胞外基质的改变,降解了细胞外基质,为肿瘤细胞的到达和定居形成一个适宜的微环境。5.VEGFR-1、CD133阳性细胞在人乳腺癌组织标本中免疫组织化学方法检测与分析,进一步验证VEGFR-1~+HPC在人乳腺癌转移中的作用。收集南方医院普外科2007年4月至2008年4月手术切除乳腺癌标本10例,10例区域淋巴结转移癌取自手术切除标本所附淋巴结,女性,患者年龄31-85岁(平均55岁)。5例淋巴结反应性增生标本取自南方医院普外科2007年8月至2008年5月。全部标本术前均未接受化疗及放疗,所有组织均用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,3μm厚切片,分别进行HE染色和免疫组织化学检测。结果:在乳腺癌患者的区域淋巴结可以检测到CD133、VEGFR-1阳性细胞。在有淋巴结转移乳腺癌患者的区域淋巴结中CD133、VEGFR-1阳性细胞簇的量较无淋巴结转移患者的区域淋巴结中CD133、VEGFR-1阳性细胞簇的量多,所形成的细胞簇包含的细胞数目较多。表明CD133、VEGFR-1阳性细胞可能与乳腺癌转移相关,可能可以做为预测乳腺癌转移的一个指标。结论1.成功地稳定转染EGFP至人乳腺癌MDA-MB-231细胞,并采用体内连续传代的方法,建立了整体可视化乳腺癌高肝转移动物模型,为研究乳腺癌转移及临床前的治疗提供了一种良好的动物模型。2.通过免疫磁珠分选技术可以得到纯度较高的CD133~+HPC,该细胞在体外培养的条件下,短期内不会诱导分化,可以保留其祖细胞特性。CD133~+HPC与乳腺癌细胞共培养可以显著促进乳腺癌细胞的体外增殖、黏附以及侵袭能力。3.VEGFR-1~+HPC在乳腺癌的转移中可能发挥重要作用。VEGFR-1~+HPC在乳腺癌细胞到达转移灶前,提前到达预转移部位,其含量随着裸鼠荷瘤时间的延长而不断增加,而且其在预转移组织的表达部位与肿瘤转移最先到达的部位基本一致。可能吸引乳腺癌细胞的迁移,并为转移瘤的形成提供适合定居的转移微环境。4.VEGFR-1~+HPC促进乳腺癌转移的作用可能与转移相关因子MMP-2、MMP-9等的表达增强有关。VEGFR-1~+HPC可能通过改变局部微环境中MMP-2、MMP-9等转移相关因子的表达为转移瘤细胞的定居与转移瘤的形成提供适宜的转移前微环境。本研究的创新之处1.建立了整体可视化乳腺癌原位接种高肝转移动物模型,为乳腺癌的实验研究提供了较理想的实验工具2.成功筛选了CD133~+HPC,发现其对乳腺癌细胞具有促增殖、黏附及侵袭的作用3.在人癌实验层次上证实了VEGFR-1~+HPC对乳腺癌转移的促进作用,为抗肿瘤转移研究提供了实验基