羽衣甘蓝(Brassica oleracea L.var.acephala DC)是十字花科芸薹属二年生草本观叶植物,甘蓝种的一个变种。其叶片形态多样,叶色绚丽如花,观赏期长,耐寒性较强,因此羽衣甘蓝被作为南北方冬季和早春重要观赏性花卉。作为一种观叶植物,其叶色丰富多样,有白色、粉色、紫色、淡黄色、红色等,因此叶色的种类和优劣直接影响其观赏价值和商业价值。本课题组先前将控制羽衣甘蓝粉色叶基因定位在甘蓝9号染色体上的二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)基因,因此本研究对不同品种羽衣甘蓝粉色叶中DFR基因全长克隆,并进行碱基序列和氨基酸序列比对;选取DFR基因cds部分片段作为沉默片段进行克隆及构建沉默载体;用含有重组载体的农杆菌菌液侵染植株,观察其表型变化,旨在确定使羽衣甘蓝叶片呈粉的主要基因,主要研究成果如下:1.对粉色叶羽衣甘蓝材料‘圆叶‘0835’’、‘裂叶‘0819’’和‘42红’DFR基因全长进行克隆和测序。将测序结果与参考基因组比对,测序结果表明:‘圆叶‘0835’’基因全长与参考基因组完全相同,其中有2个SNP位点位于第一段和第五段内含子区,对其编码区和氨基酸序列无影响,与参考基因组相同。‘裂叶‘0819’’在第三段内含子区有1bp插入,其基因全长比参考基因组多1bp;共有10个SNP位点,其中四个SNP位点位于第二、三、四段外显子区,最终第110位氨基酸发生了突变。‘42红’中有4个碱基的缺失,其基因全长比参考基因组少4bp,其中有3bp缺失位于外显子区,编码区全长比参考基因组少3bp;共有6个SNP位点,其中4个SNP位于第一段、第三段、第四段编码区,最终第14位氨基酸缺失,第12、15、16、17位氨基酸发生了突变。2.参考基因组中共有2个DFR基因,一个位于甘蓝2号染色体,一个位于甘蓝9号染色体,C2上DFR基因cds长417bp,C9上DFR基因cds长1158bp。沉默片段需要在C9选择DFR基因cds特有片段,因此将两个基因的cds进行比对,发现在第540bp位置后,剩余基因片段是9号染色体DFR基因cds所特有,最终沉默片段可以在第541bp处开始选择,并且所选沉默片段在上述三种材料中并无碱基的突变,所以本试验从725bp处开始选择,选择片段长度为271bp为最终沉默片段。对沉默片段进行克隆及构建沉默载体p TRV2-DFR。3.利用注射渗透法将不同浓度的农杆菌菌液注射到羽衣甘蓝材料‘圆叶‘0835’’中,发现菌液浓度在1.5-2.0为最适菌液浓度。‘圆叶‘0835’’在第10天出现了表型变化,叶片颜色变浅,随着时间的增加,叶片颜色更浅;‘裂叶‘0819’’未出现表型变化,‘裂叶‘0819’’叶片深裂,并且颜色集中在叶脉部分,而注射渗透法是将菌液转入到植物细胞薄壁组织,所以最终‘裂叶‘0819’’未出现表型变化。