冠心病,又称缺血性心脏病,是由于冠状动脉粥样硬化造成血管痉挛,引起血管狭窄或阻塞,产生冠脉循环障碍,造成心肌缺血、缺氧或坏死的一种心脏病。目前,国际上公认的三大治疗途径包括药物治疗、介入治疗及外科治疗。由于大多数药物对病变严重的心肌缺血治疗效果有限,而介入治疗和外科治疗又不能阻止病人的冠状动脉其他部位发生再狭窄,所以这三种治疗只能暂时缓解冠心病症状,而不能根治冠心病。20世纪末,一些学者提出了治疗性血管新生的思路,即通过某些药物的治疗增加功能性的冠状动脉分支或侧支循环,达到恢复缺血心肌血供,改善患者症状和预后的目的,有人形象地称它为“药物促进人体的自身搭桥”。研究发现,血管新生能帮助肌体建立有效的侧支循环,从根本上缓解心肌缺血症状,改善病情。目前国外大多研究利用基因方法,即直接补充VEGF或FGF等细胞因子的方法或蛋白方法及细胞移植等方法来促进冠心病患者的血管新生然而这些方法不但价格昂贵,而且目前还只是停留在研究阶段,尚无法应用于临床。完整的内皮功能在心血管疾病的发生发展过程中扮演重要角色,其功能受损导致许多血管性疾病的发生。然而,成熟的内皮细胞是终端分化细胞,其再生能力有限。大量的研究表明EPCs (endothelial progenitor cells)在受损血管内皮的自我修复中发挥重要作用,它不仅参与胚胎时期血管生成,还与损伤的血管内皮的愈合和血管新生(neovascularization)密切相关,尤其是对于前者具有重要的促进作用。它主要存在于骨髓中,在某些生理、病理状态下,可从骨髓释放到外周血,随血液循环迁移到局部血管损伤处,分化为成熟的血管内皮细胞,从而修复损伤内皮、促进血管再内皮化。寻找能够改善内皮功能促进其修复,刺激血管新生的物质受到越来越多研究者的关注中医治疗缺血性疾病的研究起源久远,并且取得了显著的成效。因此,从中药中寻找具有促进血管新生作用的药物具有重要的经济及社会意义。双参通冠方(SSTG)是由提取的人参总皂苷、丹参总酚酸、元胡总生物碱三种有效组分配伍而成,本实验室前期的药效学研究表明,该方能明显减轻急性心肌缺血犬和大鼠的心肌损伤程度,对缺血心肌有很好的保护作用。但是,之前缺少对其在促进血管新生作用、作用机理及物质基础方面的研究。本课题采用鸡胚绒毛尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM),体外培养内皮祖细胞数量、功能及冠状动脉结扎大鼠模型,观察SSTG促血管生成作用及其物质基础,探寻其作用机制,为其治疗缺血性心脏病的临床应用提供实验依据。本课题分为三个部分：一、双参通冠方(SSTG)对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管新生的影响1. SSTG及有效组分含药血清对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响目的：探讨SSTG及单味药提取物含药血清对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响。方法：将无菌8日龄鸡胚制备CAM模型,随机分成5组：对照组,SSTG、丹参总酚酸、人参总皂苷及元胡总生物碱组。将蛋壳用75%乙醇消毒后,用镊子小心开1.5cm×1.5cm的窗口,暴露CAM,将受试物品加到无菌的滤纸上,待风干后,小心置于CAM上血管较少的部位,将窗口封上,放入孵箱,于37℃,60%相对湿度继续孵育3天后,对CAM固定后,采集数据进行分析。结果：SSGT(3.25±0.80)、丹参总酚酸(3.11±0.83)及人参总皂苷组(2.97±0.47)血管密度比明显高于对照组(2.45±0.64)(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。结论：SSTG、丹参及人参可明显促进鸡胚绒毛尿囊膜血管新生。2.丹参总酚酸及丹酚酸A、B对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响目的：探讨丹参总酚酸及丹酚酸A、B对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响。方法：同前。结果：总酚酸100mg/L (2.97±0.39)、300mg/L (3.07±0.36)给药组血管密度比明显高于对照组(2.47±0.35)(P<0.05,P<0.05)；丹酚酸A 5.56mg/L(4.42±1.16)、16.67 mg/L(5.51±1.15)、50 mg/L(4.60±0.71)给药组血管密度比明显高于对照组(3.07±0.85)(P<0.05,P<0.001,P<0.01)；丹酚酸B50mg/L(2.18±0.31)、150 mg/L(2.43±0.32)给药组血管密度比明显高于对照组(1.86±0.30)(P<0.05,P<0.01)。结论：丹参总酚酸、丹酚酸A及丹酚酸B可明显促进鸡胚绒毛尿囊膜血管新生二、丹参总酚酸及丹酚酸A对内皮祖细胞(EPCs)功能的影响1.内皮祖细胞的培养及鉴定目的：建立新生鼠脾脏来源的内皮祖细胞的培养方法并对其进行鉴定。方法：密度梯度离心法分离SD新生鼠脾脏单个核细胞,EGM-2完全培养基贴壁法,37℃,5%CO2,饱和湿度的恒温培养箱中原代培养。细胞长至近融合时传代,分别于第9天进行细胞鉴定。内皮祖细胞鉴定：免疫细胞化学的CD34和VEGFR-2染色；内吞DiI标记的乙酰低密度脂蛋白(DiI-acLDL)和结合FITC标记的荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)的激光共聚焦显微镜观察及超微结构鉴定。结果：培养细胞的形态学改变：脾脏单个核细胞接种24h后部分细胞开始贴壁、变大,倒置显微镜下贴壁细胞透亮度增强,并逐渐伸出伪足样突起,呈小杆状或梭形。培养第3天贴壁细胞开始增殖,呈“集落”样生长,外周梭形细胞较多；共聚焦显微镜观察显示细胞DiI-acLDL和FITC-UEA-1呈红绿免疫双荧光阳性；培养第9天细胞VEGFR-2和CD34免疫细胞化学染色呈阳性；电镜下观察可见内皮细胞特异性的W-P小体存在；功能鉴定显示EPCs体外培养形成血管结构。结论：新生鼠的脾脏单个核细胞可以培养为内皮祖细胞并能够形成血管结构。2.丹参总酚酸对正常及H2O2损伤内皮祖细胞功能的影响目的：探讨丹参总酚酸对内皮祖细胞数量及功能的影响以及对H2O2损伤内皮祖细胞功能。方法：密度梯度离心法获取新生鼠脾脏单个核细胞,细胞长至融合状态后,收集贴壁细胞并加入丹参总酚酸(0.3,3和30mg/L)干预24h,分别观察其对EPCs的增殖、迁移、粘附、体外成管能力的影响。同时,应用200u mol/LH2O2对EPCs进行损伤,观察丹参总酚酸的保护作用。结果：丹参总酚酸促进EPC扩增,3及30mg/L丹参总酚酸作用24h对EPCs数量有显著性影响(P<0.05,P<0.05),同时也显著改善了EPCs的粘附、迁移及体外成管能力。对200μmol/LH2O2损伤EPCs的粘附及成管能力有明显的改善作用。结论：丹参总酚酸可增加EPCs数量并改善其功能并对H2O2损伤的EPCs的功能有改善作用。3.丹酚酸A对正常及H2O2损伤内皮祖细胞功能的影响及初步机制研究目的：探讨丹酚酸A对内皮祖细胞数量及功能的影响以及对H2O2损伤内皮祖细胞功能。方法：密度梯度离心法获取新生鼠脾脏单个核细胞,细胞长至融合状态后,收集贴壁细胞并加入丹酚酸A(10-9,10-8和10-7mol/L)干预24h,分别观察其对EPCs的增殖、迁移、体外成管能力的影响,并采用ELISA试剂盒检测加入丹酚酸A对培养上清中SDF-1及MMP-9含量的影响,采用NO试剂盒检测细胞上清中NO量的变化。同时,应用200μmol/LH2O2对EPCs进行损伤,观察丹酚酸A的保护作用。结果：丹酚酸A促进EPCs扩增,10-9,10-8和10-7mol/L酚酸A作用24h对EPCs数量有显著性影响(P<0.05,P<0.05),同时也显著改善了EPCs的迁移、成管能力；显著增加条件培养上清中SDF-1、MMP-9及NO的量。对200μmol/LH2O2损伤EPCs的粘附及成管能力有明显的改善作用。结论：丹酚酸A可增加EPC数量并改善其功能,其机制可能与增加SDF-1、MMP-9表达及NO的量有关,并对H2O2损伤的EPCs的功能有改善作用。三、丹酚酸A对冠脉结扎大鼠血管新生的影响及机制研究目的：探讨丹酚酸A对冠脉结扎大鼠血管新生的影响及其机制探讨。方法：结扎Wistar大鼠冠状动脉左旋降支建立心肌缺血大鼠模型,随机分为模型组,丹酚酸A 2.5、5、10mg/kg给药组,阳性对照药组及假手术组。于手术后第二天尾静脉注射给药,每天1次,7天后做以下实验：1)检测心肌缺血面积(NBT染色法)；2)HE染色观察缺血心肌的病理改变；3)免疫组化方法检测心肌梗死周围区VEGF/VEFGR-2的表达以及CD34标记的微血管密度；4) ELISA法检测血清中SDF-1及MMP-9表达量的变化。结果：与假手术组比较,模型组大鼠缺血心肌部位心肌细胞明显损伤(P<0.05),丹酚酸A 10、5剂量组梗死面积／心脏面积比值明显降低(P<0.01,P<0.05)；与假手术组比较,模型组梗死周围区CD34+细胞(P<0.05)明显增多,VEGF (P<0.001)和VEGFR-2 (P<0.001)表达明显增强,与模型组比较,丹酚酸A 10、5、2.5mg/kg剂量组梗死周围区微血管密度明显增多(P<0.001,P<0.001,P<0.001),丹酚酸A10、5mg/kg梗死周围区VEGF(P<0.001,P<0.05)和VEGFR-2 (P<0.001, P<0.001)表达显著升高；与假手术组比较,模型组SDF-1 (P<0.05)及MMP-9 (P<0.05)表达上升；与模型组比较,丹酚酸A10、5、2.5 mg/kg剂量组显著促进SDF-1 (P<0.01, P<0.05)及MMP-9(P<0.001,P<0.001,P<0.05)的表达。结论：丹酚酸A可降低心肌缺血大鼠梗死面积,其可能机制是通过上调VEGF和VEGFR-2及增加SDF-1、MMP-9的表达促进了内源性的血管新生。综上所述,首先CAM模型的结果显示：双参通冠方具有促进血管新生的作用,其有效组分丹参总酚酸及人参总皂苷也具有促CAM血管新生的作用,我们选择了丹参作为继续研究的对象,结果显示丹酚酸A比丹酚酸B有更好的促进CAM血管新生的作用；丹酚酸A促进体外培养EPCs的数量的增加及功能的改善；整体心肌缺血模型的结果显示,丹酚酸A有明显降低缺血心肌梗死面积,促进缺血后心肌MVD增加的作用,其促进血管新生的可能作用机理为通过上调VEGF和VEGFR-2及增加SDF-1、MMP-9的表达促进EPCs的动员、分化与归巢,促进了内源性的血管新生。因此,我们得出结论：丹酚酸A为双参通冠方促血管新生的有效物质基础之一。本论文的创新点：1、首次研究了双参通冠方的促血管新生作用,为用于冠心病的治疗提供实验依据；2、首次研究了丹酚酸A的促血管新生作用,并对其作用机制作了初步研究。