经典的固醇类激素的作用是通过核受体途径发挥的。但越来越多的证据表明，固醇类激素还可通过所谓的膜受体途径激活胞内信号分子而发挥作用，所以研究固醇类激素的膜受体就显得特别有意义。 寡霉素敏感相关蛋白(oligomycin sellsitivity-conferring protein, OSCP)是ATP合成酶／ATP酶的一个亚单位。ATP合成酶／ATP酶是一个跨膜的多亚基复合体，广泛存在于线粒体、细菌、叶绿体的胞壁膜上，包括位于膜外的F1、位于膜内的FO以及连接二者的OSCP三部分组成。F1是ATP合成酶／ATP酶的活性中心，它可以催化ATP的合成和分解；FO作为质子通道，参与光合磷酸化和氧化磷酸化中能量的转化。OSCP作为联系FO和F1的桥梁，在生物体能量转化中发挥重要作用。寡霉索可与OSCP特异结合，抑制质子流通过FO，使ATP的生成受到阻抑。 1996年，Ramirez等分离、纯化雌性大鼠脑神经细胞膜组分，使其通过填充有雌二醇的亲和层析柱，然后将吸附于亲和柱上的物质洗脱，进行SDS-PAGE。其中只有突触膜组分的洗脱液经过SDS-PAGE后，在23KD(a)处发现一特异条带，经蛋白质测序分析，确定此物质为OSCP。表明雌性大鼠神经细胞突触膜上存在有OSCP，并与雌二醇有高度亲合力，随后的实验进一步证明该蛋白很可能是一种雌激素膜表面受体。另有报道称，线粒体蛋白ATP合成酶／ATP酶的活性可被雌激素快速抑制，很可能是雌激素通过与OSCP结合，调节质子流的跨膜运动，从而调节细胞能量代谢。由此可 Sha队i卜I匕dieaIL下niversityl!le、、，‘，一kfo一卜laster见，某些情形下，雌激素发挥其功能与OSCP有着密切关系，故深入研究OSCP的结构和功能就有特别的意义。目的本实验选取了OSCP基因的开放启司读框共684个核首酸序列，进行体外扩增和克隆，随后成功地表达出了大鼠的OSCP，为进一步{J};究这一:l丁能的雌激素膜受体的结构和功能及其作用力一式创造了条件。方法(l)构建大鼠OSCP基因重组质粒:分离3周龄雌性SD大鼠脑组织，提取总R刊A。根据OSCP基因的开放阅读框设砂「合成1对引物。用RT一PCR方法扩增出编码OSCP基因的全长序列，分离纯化PCR产物，将其与pGEM一T easy质粒连接，并转化入JM 109感受态细胞，摇菌妇L增，提取质粒DNA。酶切鉴定，DNA序列分析，用以检测所克隆的大鼠OSCP基因重组质粒pGEM一T easy一OSCp。 (2)通过基因改造获取正确的OSCP基因亚组体:通过DNA序列分析发现所得克隆发生J点突变，造成编码氨基酸的三联体密码子发生有义突变。选取两克隆，采用限制性内切酶将发生突变的部位切除，然后通过T4DNA连接酶将未突变序列连接起来，经酶切鉴定，ONA序列分析，)}J以证明所获得的大鼠OSCP基因重组体是否改造成功。 (3)构建大鼠OSCP基因的原核表达菌株，并进行蛋自表达及活性柴定:将正确的OSCP基因重组体亚克隆入融合表达载体PET一28c(+)中，转化BLZI感受态细胞，摇菌扩增，提取质粒DNA，酶切鉴定，检测是否构建成功大鼠OSCP基因的原核表达菌株PET一28。(+)一OSCP。IPTG诱导表达后，经505一PAGE分离所表达出的融合蛋自。随后通过将SDS一PAGE所分离出的融合蛋白转移到硝酸纤维素膜上，先后川兔抗大鼠OSCP的多克隆抗血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔!gG对峭酸纤维素膜进行封闭，最后进行X片曝光、显影、定影的蛋自印迹技术进行鉴定S】lanxi入Iedieal Universit、l】一e认，01长for Master结果oscP基因的开放阅读框全长684bp，根据其序列设计的PcR引物包含了该阅读框起始密码子及其终止密码子后的16bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示RT一PCR产物的长度为700bp，与顶J明结果相符。将RT一PcR产物纯化、连接入pGEM一T easy质粒载体，提取质粒DNA，酶切结果提示获取了大鼠oSCP基因重组质粒pGEM一T easy一oscP。但DNA序列分析结果提示，克隆Cl在第99bp处的碱基A突变为G，克隆CZ在300bp处缺失一碱基A。为了纠正上述突变，将克隆CZ下游的部分多克降位点(主要是EcoRI酶切位点，目的是为下一步亚克隆pGEM一T easy一OSCP中插入片段与原核表达载体PET一25。(+)的连接准备条科几)jl]spel+Pstl双酶切删除，然后通过Klenow片段补平、T4DNA连接酶连接，制备得到亚克隆CZ。再用Sacl以及插入片段，}，的PPuMI分别共同消化亚克隆CZ和克隆cl，去掉突变部位重新连接，以制备亚克隆pGEM一T easy一OscP。提取质粒DNA，酶切及ONA序列分析结果提示，得到一有正确OSCI〕基因序列的新克隆。然后将有正确序列的新克隆中的插入少日没亚克隆入原核表达载体PET一28c(+)，提取质粒DNA，酶切结果提示，构建成功了大鼠OsCP基因的原核表达菌株PET一28c(+)一oscl〕。经Il，TG诱导表达，12%的SDS-PAGE呈现出一约23KD(a)的特异表达带，再将融合蛋自转移到硝酸纤纤i:素膜上，用兔抗大鼠OSCP的多克隆抗血i青及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔lgG检测，经x片曝光、显影、定影，可见一oSCI，的特异条洲;:。结论在国内初次克隆了大鼠OSCP基因，并成功构建了大鼠OSCP白勺基因重组质粒;通过基因改造成功地进行了大?