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目的:根据中医辨证理论,癌症患者往往多种发病机制并存,故治疗上也是多种治疗方法并用。目前的研究成果表明,中药主要通过以下几个方面发挥临床功效:调节免疫功能,抑制肿瘤新生血管的生成,诱导细胞分化,促进细胞凋亡,直接杀伤肿瘤细胞,逆转肿瘤细胞的多药耐药,抗突变作用,抗肿瘤细胞的转移。中药抗肿瘤是多方向、多途径发挥作用的,在临床中应坚持辨证论治与辨病论治相结合。斑蝥为芫菁科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥全虫,现代药学研究表明其主要药用成分是斑蝥素。斑蝥酸钠是斑蝥素经过氢氧化钠水解生成的,其与维生素B6组成的复方制剂斑蝥酸钠维生素B6注射液在保留斑蝥素抗癌作用的同时,其抗癌谱更广,毒副作用更小。斑蝥酸钠维生素B6注射液治疗恶性肿瘤在临床上已得到广泛应用,过去的研究表明其抗癌机制主要是细胞毒作用,对于其它作用机制的研究,如通过调节免疫功能抗肿瘤的研究也只是局限于临床研究。而对于其抑制肿瘤新生血管的生成、诱导细胞分化、促进细胞凋亡、逆转肿瘤细胞的多药耐药、抗突变作用、抗肿瘤细胞的转移等机制的研究尚未见相关报道。本研究首次通过体外试验,应用MTT法、流式细胞术、放射免疫、RT-PCR等多种方法,试图从细胞、分子和基因水平研究斑蝥酸钠维生素B6注射液对T淋巴细胞增殖和分泌IL-2、IL-4和趋化因子IL-8的影响,以进一步探讨斑蝥酸钠维生素B6注射液的免疫调节作用和抑制肿瘤新生血管生成的作用,为斑蝥酸钠维生素B6注射液的进一步研发和临床应用提供更加可靠的理论和实验依据。方法:1外周血单个核细胞的分离:抽取恶性肿瘤患者静脉血,采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞即淋巴细胞。2 MTT法测定植物血球凝集素(Fhytohomaggiutinin, PHA)诱导的T淋巴细胞的增殖反应:将上述制备好的细胞悬液加入96孔培养板,设空白对照组、PHA对照组和7个不同药物浓度的实验组,T淋巴细胞培养72小时后倒置显微镜下观察形态学变化,用酶标仪测OD值。选两个促增殖作用最明显的药物浓度组为实验组并设PHA对照组进行后续试验。3流式细胞仪测定T淋巴细胞周期:细胞进行培养,收集细胞,用流式细胞仪检测细胞周期。4放射免疫法测定IL-4和IL-8的含量:实验组和对照组细胞进行培养后留取上清液,用IL-4和IL-8放免药盒检测其含量。5 RT-PCR测定T淋巴细胞内IL-2mRNA的含量:实验组和对照组细胞进行培养,收集细胞,提取细胞总RNA。采用一步法进行反转录和扩增。将RT-PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳后,应用凝胶成像系统及凝胶分析软件对电泳条带进行成像分析,用IL-2吸光度与β-actin吸光度的比值代表IL-2的相对含量。6所有数据均用x±s表示,用SPSS11.5统计软件进行处理,多组间比较用方差分析,实验组与对照组间比较用SNK-q检验,P<0.05有统计学意义。结果:1在PHA协同刺激下,细胞培养72小时后,倒置显微镜观察各组细胞均呈现集落状生长,其中0.010ug/ml组细胞集落较PHA对照组明显增多,1.000ug/ml组细胞集落较PHA对照组减少。MTT结果显示:斑蝥酸钠维生素B6注射液在一定范围内,能刺激外周血T淋巴细胞的增殖,且随着药物浓度的增高促增殖作用增强。但当药物达到一定浓度时,随着浓度的增高促增殖作用减弱,达到较高浓度时甚至有杀伤T淋巴细胞的作用。其中促增殖作用最强的两个浓度为0.010ug/ml和0.050ug/ml。2适当浓度的斑蝥酸钠维生素B6注射液可以促进T淋巴细胞的活化,促进细胞由G0/G1期向S期转化。两个实验组的S期细胞百分率与对照组的S期细胞百分率相比差异有统计学意义(P<0.05)。3两个实验组IL-8的分泌与对照组相比降低且有统计学意义(P<0.05)。两个实验组之间相比无统计学意义(P>0.05)。4 IL-4的分泌显示出随药物浓度增高而增高的趋势,但无统计学意义(P>0.05)。5适当浓度的斑蝥酸钠维生素B6注射液可以促进T细胞内IL-2mRNA的表达,两个不同实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。0.050ug/ml实验组的作用较0.010ug/ml实验组弱,且两个不同实验组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1在PHA协同刺激下,斑蝥酸钠维生素B6注射液在体外对T淋巴细胞有促进增殖作用,这种促进增殖作用是通过促进细胞从G0/G1期向S期转化而实现的。斑蝥酸钠维生素B6注射液可能通过促进T淋巴细胞的增殖直接增强机体的免疫功能而发挥抗肿瘤作用。2当斑蝥酸钠维生素B6注射液药物浓度达0.010ug/ml,促增殖作用最明显,0.050ug/ml促增殖作用也比较明显,随着药物浓度的增加,促增殖作用减弱,当达到一定浓度时出现抑制作用。提示我们临床应用斑蝥酸钠维生素B6注射液时浓度应适宜。3斑蝥酸钠维生素B6注射液可能通过下调淋巴细胞分泌趋化因子IL-8,进而减少肿瘤血管生成而起到抗肿瘤作用。4斑蝥酸钠维生素B6注射液虽有促进IL-4分泌的趋势,但差异无统计学意义。是否由于样本量小造成的或是其它原因,有待进一步研究。5斑蝥酸钠维生素B6注射液还能促进IL-2mRNA的合成,使IL-2分泌增加,从而发挥增强机体免疫功能而间接治疗肿瘤的作用。