兔病毒性出血症(RHD)也被称为兔瘟。兔瘟是一种急性的、败血性的、高度传染性及高致死性的疾病,以兔全身实质性脏器出血为主要临床特征。兔出血症病毒(RHDV)为单股正链RNA病毒,基因组全长约7.5 Kb。目前,对于该RHDV尚无一个系统性基因组的监测方法与稳定的培养细胞系统,严重影响着RHDV的细胞侵染机理和防控等方面的研究。因此本文建立了RHDV基因组SYBR Green荧光定量RT-PCR的检测方法和兔脾脏源细胞建系,并进行建系细胞的RHDV初步感染试验,具体内容如下:1、根据RHDV的基因结构,在本文中,设计七对引物对本试验室保存的RHDV SCH07株基因组进行扩增。通过优化的最佳反应条件,建立了一组RHDV基因组的SYBR Green荧光定量RT-PCR的检测方法。再对其灵敏度、特异性、重复性试验进行了检测。该方法与兔巴氏杆菌,兔沙门氏菌,兔大肠杆菌和RHDV b无交叉反应,最小检测值为10~4拷贝/μL,批内和批间的变异系数均小于3%。结果表明,该方法具有灵敏度高,特异性强,稳定性好,精度高和快速检测的优点。2、在培养乳兔原代细胞的过程中,从脾脏组织中分离出一株成纤维样细胞,在原代细胞的培养过程中在其表面形成一层与其形态不同的细胞,并且生长速度快于原代细胞,通过细胞分离法将该株细胞从原代细胞中分离出来并将其命名为RS17-2。通过对RS17-2细胞传代培养条件优化、细胞标志性蛋白检测、细胞生长曲线、细胞核型等进行测定,以对细胞的生长特性以及生物学特性进行研究。结果显示该细胞系具有血清依懒性、成纤维细胞标志性蛋白检测阳性、具有正常的核型,且目前细胞传至150代仍可稳定生长。这为RHDV感染机制相关研究提供了细胞材料。3、用RHDV SCH07株对RS17-2细胞系进行感染以及SCH07株RNA在该细胞系转染研究,感染后观察细胞的CPE并收取细胞利用建立的荧光定量方法进行检测。该细胞在首次感染时细胞出现CPE,但是随着继续盲传,细胞CPE减弱,荧光定量检测病毒核酸含量随着传代次数增多而减少,盲传第6次后细胞病毒核酸检测阴性;RNA转染该细胞系后,随着时间延长,细胞皱缩变多,但时间梯度之间细胞的CPE差别不明显,荧光定量检测细胞病毒核酸含量阳性。为进一步RHDV对细胞内部的侵染机制研究提供了科学参考。