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稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是全球稻区广泛发生的毁灭性水稻真菌性病害,每年都给水稻生产造成重大损失。随着世界人口的不断增长,耕地面积的不断减少,粮食需求量激增。由于稻瘟病菌小种易变异,选育高产抗病的水稻品种或药剂防治都无法实现稻瘟病菌的高效防控。近年来,随着稻瘟病菌全基因组测序完成,关于稻瘟病菌致病分子机理的研究和遗传转化体系日益成熟,这让全面了解稻瘟病菌的生长及致病机制,开发新的杀菌剂靶标成为可能。
稻瘟病菌侵染水稻需要其体内新陈代谢的正常运转。新合成的蛋白分子功能的实现,必须要被运送到适当的位置,具有转运功能的蛋白在这个阶段发挥着重要作用。高尔基体是由数个扁平囊泡聚集在一起形成的细胞器,常分布于内质网与细胞膜之间。高尔基体的主要功能是将内质网合成的蛋白质进行加工、分类与包装,然后分门别类地运送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。高尔基体是完成细胞分泌物(如蛋白)最后加工和包装的场所。从内质网运输来的小泡与高尔基体膜融合,将内含物送入高尔基体腔中,在那里新合成的蛋白质肽链继续完成修饰和包装。高尔基体还合成一些分泌到胞外的多糖和修饰细胞膜的材料。Arl1是定位在高尔基体上的一个小G蛋白,从酵母到哺乳动物中它都是高尔基体结构和功能的重要调节因子。Arl1与其效应分子一起已被证明参与到多个细胞过程,包括内质网与高尔基体以及外泌小体之间的物质运输,脂质和唾液颗粒的形成,先天免疫和神经元的发育,胁迫应答,以及非折叠蛋白反应等。然而,在丝状真菌中对Arl1以及其互作蛋白的研究甚少,因此筛选稻瘟菌中与Arl1互作的蛋白具有重要意义。
实验室前期研究发现,稻瘟病菌的MoArl1参与调控病菌的生长发育及致病过程,但是其具体的调控机制尚不清楚。因此,本论文拟通过酵母双杂交实验筛选MoAdl的互作蛋白,并解析互作蛋白的生物学功能,从而揭示MoArl1调控稻瘟病菌生长发育和致病性的分子机制。主要研究结果如下:本实验通过筛选稻瘟病菌cDNA文库得到MoArl1的候选互作蛋白18个,Aip1/18。这18个蛋白大多数为假定蛋白,其中还有泛素化硫酯蛋白,真核翻译起始因子3,FK506结合蛋白1B,纤维素信号相关蛋白特使和磷酸甘油酸变位酶。在这18个蛋白中选出5个构建双杂载体与MoArl1Q71L进行一对一的互作验证,得到2个与其互作的蛋白MoAip1/2(Arl1Interaction Protein)。进一步利用同源重组的原理对MoAIP1/2基因进行敲除,获得了MoAIP1的敲除突变体。目前对MoAIP2基因验证了300个以上的转化子但仍未获得该基因的敲除突变体,因此推测MoAIP2可能是致死基因。对△Moaip2敲除突变体进行其表型分析,结果发现△Moaip1产孢量显著下降,但是附着孢的形成以及致病力与野生型相比并无显著差异。突变体在营养生长,胁迫耐受性方面也与野生型无显著性差异。观察了MoAip1/2的亚细胞定位,发现它们均定位在细胞质中且MoArl1不改变它们的定位。
稻瘟病菌侵染水稻需要其体内新陈代谢的正常运转。新合成的蛋白分子功能的实现,必须要被运送到适当的位置,具有转运功能的蛋白在这个阶段发挥着重要作用。高尔基体是由数个扁平囊泡聚集在一起形成的细胞器,常分布于内质网与细胞膜之间。高尔基体的主要功能是将内质网合成的蛋白质进行加工、分类与包装,然后分门别类地运送到细胞特定的部位或分泌到细胞外。高尔基体是完成细胞分泌物(如蛋白)最后加工和包装的场所。从内质网运输来的小泡与高尔基体膜融合,将内含物送入高尔基体腔中,在那里新合成的蛋白质肽链继续完成修饰和包装。高尔基体还合成一些分泌到胞外的多糖和修饰细胞膜的材料。Arl1是定位在高尔基体上的一个小G蛋白,从酵母到哺乳动物中它都是高尔基体结构和功能的重要调节因子。Arl1与其效应分子一起已被证明参与到多个细胞过程,包括内质网与高尔基体以及外泌小体之间的物质运输,脂质和唾液颗粒的形成,先天免疫和神经元的发育,胁迫应答,以及非折叠蛋白反应等。然而,在丝状真菌中对Arl1以及其互作蛋白的研究甚少,因此筛选稻瘟菌中与Arl1互作的蛋白具有重要意义。
实验室前期研究发现,稻瘟病菌的MoArl1参与调控病菌的生长发育及致病过程,但是其具体的调控机制尚不清楚。因此,本论文拟通过酵母双杂交实验筛选MoAdl的互作蛋白,并解析互作蛋白的生物学功能,从而揭示MoArl1调控稻瘟病菌生长发育和致病性的分子机制。主要研究结果如下:本实验通过筛选稻瘟病菌cDNA文库得到MoArl1的候选互作蛋白18个,Aip1/18。这18个蛋白大多数为假定蛋白,其中还有泛素化硫酯蛋白,真核翻译起始因子3,FK506结合蛋白1B,纤维素信号相关蛋白特使和磷酸甘油酸变位酶。在这18个蛋白中选出5个构建双杂载体与MoArl1Q71L进行一对一的互作验证,得到2个与其互作的蛋白MoAip1/2(Arl1Interaction Protein)。进一步利用同源重组的原理对MoAIP1/2基因进行敲除,获得了MoAIP1的敲除突变体。目前对MoAIP2基因验证了300个以上的转化子但仍未获得该基因的敲除突变体,因此推测MoAIP2可能是致死基因。对△Moaip2敲除突变体进行其表型分析,结果发现△Moaip1产孢量显著下降,但是附着孢的形成以及致病力与野生型相比并无显著差异。突变体在营养生长,胁迫耐受性方面也与野生型无显著性差异。观察了MoAip1/2的亚细胞定位,发现它们均定位在细胞质中且MoArl1不改变它们的定位。