目的人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是一种逆转录病毒,是引起获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)的病原体。目前全球有大约3340万HIV感染者,2009年新增感染者270万人。截至2009年底,估计中国存活艾滋病感染者和病人约74万人,2009年新发艾滋病感染者4.8万人,其中32.5%的新感染者是男男性行为者。变异性是HIV的重要特征之一。HIV-1基因组中以膜蛋白编码基因的变异程度最高,在同一亚型中env基因差异为7～20%,不同亚型间env基因差异可达20～35%。目前研究认为当病毒感染新的个体时,大约80%是单一病毒株传播,在新宿主体内,病毒的高突变率以及宿主的免疫压力使得病毒得以快速变异。在env基因区域,突变率每年高达1%。在整个病程中,个体内HIV-1进化由病毒的多样性决定,除了基因漂移和纯化选择外,HIV-1的进化也受中和抗体和CTLs的阳性选择。研究发现HIV-1感染21-28天后病毒载量达到峰值,随后病毒水平迅速降低达到稳定的状态即病毒调定点(setpoint) [9],目前国际公认将病毒调定点的高低作为判断感染者生存期长短及预后的关键指标。由于setpoint的重要性,学者们格外关注在setpoint之前到底发生了什么,为什么有些相同或相似的病毒感染不同的宿主却形成不同的setpoint和预后。但是由于急性期感染者队列建立和维持非常困难,目前关于这方面的研究资料尚很有限。本研究以HIV-1原发感染患者为研究对象,以前瞻性队列研究的方式,高密度随访观察感染早期病毒复制水平的动态变化,以HIV-1基因组中膜蛋白编码区gp160为研究目标,经TA克隆的方法获取感染后最早时间点和病毒调定点时期的准种序列,进行个体内病毒N-糖基化位点、辅助受体、遗传多样性、趋异性、特征性氨基酸变异及不同时间点的上述病毒特征演变分析,并分析上述各项指标与病毒调定点高低的关系,以期从分子水平探讨HIV-1患者病毒调定点的形成机制,揭示HIV-1感染早期病毒的生物学特征、寻找保护性免疫应答的相关因素,为HIV感染的治疗和疫苗设计提供新的思路。方法1、研究对象12例未经抗病毒治疗原发感染病例,分析并比对每例原发感染者最早时间点及setpoint点病毒env基因的变化。并根据HIV-1感染后4-24月内,病毒载量相对稳定,定义病毒载量调定点的时间。根据setpoint点病毒载量水平分为高setpoint组(>4 log10copies/mL)和低setpoint组(<4 log10copies/mL)。2、CD4+T淋巴细胞测定20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入TruCOUNT管中,加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,用FACS MMLTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。3、病毒载量测定以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA,采用Roche公司HIV-1Monitor 1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为400-750,000copies/ml。4、病毒核酸提取、RT-PCR以抗凝140μl血浆提取病毒基因组RNA,按照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书步骤提取RNA,提取物溶于60μl洗脱液中。RT反应体系基于SuperScript(?)ⅢReverse Transcriptase Kit (invitrogen)5、巢氏聚合酶链反应(nest-PCR)以外侧引物对：AEOF (5’-TAGAGCCCTGGAATCATCCGGGAAG-3’ HXB2 5853-5877nt)和AEOR (5’-TTACTACTTGTTACTGCTCCATGT-3’HIV-1HXB28936-8913nt);内侧引物对：UIF (5’-CACCTTAGGCATCTCCTATGGCAGG AAGAAG-3’HIV-1HXB27850-7879nt)和AEIR (5’-AGCTGGATCCGTCTTGAGATA CTGCTCCTAC-3’HIV-1HXB28914-8884nt),用于扩增HIV-1 gpl60序列。6、PCR反应产物纯化取终产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳,经Ultra-Violet Product凝胶成像后与marker比对,确认所需片段,用QIAquik Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。7、TA克隆扩增的gp160基因3000bp片段插入克隆载体pMDTM18-T Simple Vector,转入化学感受态菌DH5a扩大培养,然后提取质粒DNA双脱氧终止法测序。8、序列分析经PCR扩增和测序得到]HIV-1 gp41基因的基因序列片段,然后用Contig软件进行拼接,用BioEdit软件进行序列比对。用MEGA3软件的进行系统树分析,并计算基因离散率及趋异性。使用网上工具(http://www.hiv.lanl.gov)分析同义替代及非同义替代、Highlighter、N-Glycosite site。利用网络工具IEDB Analysis Resource,根据本实验室前期获得的患者HLA-I等位基因分型信息,预测样本的HLA-I限制性CTL表位,选取IC50低于50nM的表位进行多肽特征和变异分析。使用Simplot软件进行重组断点分析。使用Geno2pheno[coreceptor]软件,进行细胞嗜性的预测。9、统计学分析用SPSS15统计软件进行统计分析；数据使用均数±标准差及中位数±95%可信区间；用non-parametric Wilcoxon rank-sum test分析不同时间点毒株的PNGs数量和env区变异环长度的不同；用Spearman秩相关进行相关性分析；p<0.05为有统计学意义。结果一、膜蛋白基本特征1、env变异环的长度分析在感染最早期,高病毒setpoint组V1、V2、V4区长度有高于低病毒setpoint组趋势,而V5区长度有低于低病毒setpoint组趋势,但上述差异均未达显著性水平；在setpoint点,两组上述各区域的变化仍未发生显著性差异。两组随着时间的推移各区的变化如下：在V1区,高病毒setpoint组无明显变化,低病毒setpoint组V1有变短趋势；V2区与V3区两组均无明显变化；V4区与V5区两组均有变短趋势,但差异均未达显著性水平。2、N-糖基化位点(PNGs)在感染最早期,高病毒setpoint组V1、V2、V5区PNGs数量有低于低病毒setpoint组趋势,而V3、V4区、gp41胞外区PNGs数量有高于低病毒setpoint组趋势,但上述差异均未达显著性水平；在setpoint点,两组在上述各区域的PNGs数量上仍无显著性差异。两组随着时间的推移各区的变化如下：在高病毒setpoint组与低病毒setpoint组中V1区与V4区的PNGs均有减少趋势；在V2区和gp41胞外区,高病毒setpoint组PNGs数量有增加趋势,低病毒setpoint组则有减少趋势；在V3区,高病毒setpoint组的PNGs数量无明显变化,低病毒setpoint组则有增加趋势；在V5区,高病毒setpoint组的PNGs数量有减少趋势,低病毒setpoint组则有增加趋势,但上述差异均未达显著性水平。3、细胞嗜性预测结果12例HIV-1原发感染者感染毒株在感染早期以CCR5嗜性的病毒株为主,占83.3%,高病毒病毒setpoint组病毒准种全部为CCR5嗜性,低病毒setpoint组50%的感染者准种为CXCR5。1例经异性性传播感染者在感染早期病毒准种为CCR5嗜性,但其setpoint时的病毒准种转变为CXCR4嗜性。二、HIV-1 env进化特征1、同一感染者个体内最早期和调定点的病毒多样性分析按照Fiebig分期比较,Ⅱ期时,高病毒setpoint组多样性低于低病毒setpoint组；而在Ⅳ与Ⅳ期,高病毒setpoint组多样性高于低病毒setpoint组。2、多样性率高病毒setpoint组多样性率与低病毒setpoint组多样性率无显著性差异(p=0.458)3、核苷酸趋异性和氨基酸趋异性分析高病毒setpoint组趋异性有高于低病毒setpoint组的趋势(P=0.105)。线性回归模型提示基因距离与VL的对数呈正相关(r=0.162,p=0.157)。高病毒setpoint组比低病毒setpoint组具有较高的氨基酸趋异性(p=0.157),与基因趋异性具有相同的特点。4、dN/dS ratios高病毒setpoint组dN/dS显著高于低病毒setpoint组(p=0.002)；同时我们发现高病毒setpoint组dS同样高于低病毒setpoint组dS(p<0.001)。而高病毒setpoint组dN和低病毒setpoint组dN具有相似性(P=0.308)。5、不同感染者体内同源病毒进化差异的研究通过流行病学及全长env基因分析发现12例原发感染者中存在2对同源传播对,其中一对为高度同源株单一病毒株传播,而另外一对情况较复杂,其中一例为单一病毒株传播,另一例则感染了2株病毒,其感染先后时序不明。结论1、辽宁MSM人群HIV-1 AE亚型原发感染者,单一病毒株的感染比较普遍。同时,我们也发现了一例2种毒株感染的个体。2、原发感染者,serpoint点和最早期相比,变异环长度和PNGs数量没有变化或者变化较小,两组没有显著性差别。3、原发感染者,个体内最早期的病毒多样性,因感染早期所处的Fiebig分期不同而不同；且setpoint点病毒载量水平与病毒趋异性相关。4、Setpoint点,dN/dS、dS与病毒载量呈正相关,两组具有显著性差别。