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背景:趋化因子CXCL9（C-X-C motif chemokine 9）是缺乏ELR结构域的CXC趋化因子亚族之一,可趋化T淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞,在白细胞运输中起关键作用,作用于活化的CD4+Th1细胞,CD8+T细胞,IL-2活化的T淋巴细胞和NK细胞等。CXCL9在许多疾病中发挥重要作用,包括外部感染、肿瘤治疗、自体免疫性疾病、移植排斥反应等,最近报道CXCL9在肿瘤化疗中具有保护造血干细胞的作用。然而,CXCL9在大肠杆菌系统中表达易形成包涵体,通过变性复性过程获得,不仅增加纯化步骤,增大生产过程中的经济及时间成本,并且变性过程存在疏水区过度暴露的风险,蛋白空间结构改变可能导致最终产物的生物学活性较差。因此,可溶表达对提高大肠杆菌生产CXCL9的规模化生产具有关键意义。本研究中,我们探讨内含肽介导的CXCL9重组蛋白可溶性表达纯化系统建立及应用,对原有制备工艺进行优化,实现CXCL9的可溶性表达及高效纯化。方法:本研究中,我们借助低温诱导和内含肽系统实现CXCL9在大肠杆菌内的可溶性表达。采用具有C端自剪切功能的内含肽?I-CM,本课题构建了3种“标签+?I-CM+CXCL9”组合,以蛋白可溶性为主要判断标准,筛选最优组合。进一步优化温度表达条件后,选择Zbasic-?I-CM-CXCL937°C融合表达和25°C条件下低温诱导表达的产物进行纯化。我们根据目的蛋白的相关性质进行了一系列纯化方案探索,最终确定了“SP FF（阳离子交换色谱）→CHT I（陶瓷羟基磷灰石柱色谱）”的两步纯化策略。采用该策略,将可溶表达的CXCL9从细菌裂解上清中纯化出来:阳离子交换色谱作为第一步粗纯方法,用SP FF强阳离子交换介质纯化并浓缩。得到的洗脱产物超滤脱盐,第二步用CHT I精纯得到最终产品。为了与Zbasic-?I-CM促溶系统和低温诱导促溶对比,我们参照文献报道重复了包涵体的变复性工艺,37°C诱导得到的菌体裂菌后收集沉淀,用8 M尿素溶解后于pH 6.0稀释复性,再调节pH至7.2后上样,采用SP FF一步纯化得最终产品。结果:通过比较FATT、Fh8和Zbasic三个促溶标签,Zbasic-?I-CM-CXCL9融合表达策略在37°C下能够得到较优的可溶效率和较高的表达量。优化可溶表达条件后,发现25°C条件下低温诱导表达可以达到较好的单独CXCL9可溶性表达的最优产量。因此,我们分别采用Zbasic-?I-CM可溶表达系统、低温诱导表达系统、包涵体变复性表达系统进行CXCL9的纯化研究,并考察其效率。为了评价三种方法所得CXCL9产品的质量特征,我们建立了一系列包括考马斯亮蓝（SDS-PAGE）电泳分析,分子筛排阻色谱（SEC-HPLC）检测样品纯度,和超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-MS）质谱仪测定蛋白完整分子量的检测方法。结果显示纯化所得CXCL9产品纯度超过97%,结构完整,LC-MS相对分子量符合预测值。我们利用HUVEC细胞增殖实验检测终产品的活性,IC50为4.13-8.33μg/mL,表明纯化所得的CXCL9均具有一定的生物学活性。Zbasic-?I-CM系统有效实现了CXCL9的高效可溶表达纯化,省时节能成本低廉,为开发新型的适用于更多细胞因子类药物生产的表达系统提供参考。