铁是人体必需的微量元素之一,是多种含铁酶的组成部分,广泛参与机体的代谢过程。适量的铁对于生物体的生存、分化和繁衍都具有十分重要的意义,但是过量的铁具有毒性作用。铁通过Fenton反应(Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+·OH+OH^-)产生羟自由基,也可通过铁催化的Haber-Weiss反应(Fe³⁺+O₂^-→Fe²⁺+O₂;Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+·OH+OH^-（iron catalayzed）)加剧体内的氧化应激,导致组织、细胞损伤。因此,脑内铁代谢是十分精细的平衡过程,从血清铁跨越血脑屏障,到脑细胞摄取铁,每个环节都受到复杂而严密的调控。以前认为脑内铁稳态的维持,主要是依靠对铁摄取的调控来实现的。但越来越多的研究表明,脑铁的储存和释放也对脑铁稳态的维持起着重要作用。研究发现,在一些神经变性性疾病,例如:AD（Alzheimer’s disease）、PD（Parkinson’s disease）、亨廷顿（Huntington’s disease）舞蹈病中,病人脑内出现铁的重新分布和部分脑区的铁沉积。现已证实,过量铁是导致上述神经退行性疾病发病的重要原因之一。但是,引起部分脑区铁蓄积的原因尚未完全阐明。国内外有研究者发现,应激机体存在铁重新分布的现象。本室前期所做的一些实验也发现诸如晕船、运动和疲劳刺激可以使得铁元素在体内出现重新分布。我们的研究还发现,心理应激大鼠皮层、海马和纹状体内总铁含量以及非蛋白结合铁含量显著升高,该脑区铁调节蛋白1和转铁蛋白受体表达增多。而应激可通过提高GR和STAT5的转录调节活性,增加大鼠海马内铁调节蛋白1的表达量,进而使转铁蛋白受体表达量增加。这些结果显示,应激反应可影响脑组织铁摄取机制。但是,应激反应是否对铁的储存和释放也有影响还不清楚。本文为阐明此问题进行了系统的研究。目的了解心理应激对大鼠脑铁储存和释放蛋白的影响及其机制,为阐明心理应激与中枢神经退行性疾病的关系以及深入探讨军事应激损伤的生物学机制提供实验基础,并为预防以脑铁代谢紊乱为主要病理改变的疾病治疗提供新的思路。方法1.心理应激对大鼠脑内非血红素三价铁（NHF III）和非血红素二价铁（NHF II）的影响1.1实验动物分组雄性SD大鼠（购自上海西普尔-必凯公司）,体重（120士5）g。按体重随机分为空白对照组（CG）、心理应激组（PSG）和足底电击组（FSG）。动物饲养实验室环境温度24℃±1℃,湿度50%～60%;使用不锈钢笼具单笼饲养,自由饮食,自然昼夜节律变化光照。1.2大鼠心理应激模型的制作采用Communication Box System制作大鼠心理应激模型。CommunicationBox System由透明丙烯酸板组成,一半小室（A室）底部铺板绝缘,另一半小室（B室）通电。在B室的实验大鼠接受30min/d,足底电击（电击信号由JL-B双脉冲电刺激器发生,经放大器产生电压70V,电流0.70mA）;电击组大鼠跳跃,尖叫,在A室的实验大鼠通过视觉听觉产生恐惧的心理反应,即为心理应激大鼠模型。共7天。1.3大鼠脑组织灌注铁染色1.3.1大鼠脑组织普鲁士蓝灌注铁染色（perfusion-Prels method）在第七天造模完成后即刻腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉,暴露胸腔,剪开右心耳,然后迅速经心脏插管用含有肝素钠（5单位/ml）的PBS溶液150ml冲洗血液,然后800ml含有1%亚铁氰化钾4%多聚甲醛灌流液（PH1.0）固定,取脑组织采用石蜡切片制成5μm切片用于铁染色。参照包新民大鼠脑立体定位图谱,在每只大鼠耳间线嘴侧3.6-3.8mm处行冠状切片显示大鼠海马;耳间线嘴侧7.8mm-8.0mm处冠状切片显示大鼠纹状体及额叶皮层。1.3.2大鼠脑组织滕氏蓝灌注铁染色（perfusion-Turnbull method）在第七天造模完成后即刻腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉,暴露胸腔,剪开右心耳,然后迅速经心脏插管用含有肝素钠（5单位/ml）的PBS溶液150ml冲洗血液,然后800ml含有1%铁氰化钾4%多聚甲醛灌流液（PH1.0）固定,取脑组织采用石蜡切片制成5μm切片用于铁染色。参照包新民大鼠脑立体定位图谱,在每只大鼠耳间线嘴侧3.6-3.8mm处行冠状切片显示大鼠海马;耳间线嘴侧7.8mm-8.0mm处冠状切片显示大鼠纹状体及额叶皮层。2.心理应激对大鼠脑细胞铁储存蛋白和铁释放蛋白的影响2.1实验动物分组及模型制作:同前2.2心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内膜铁转运蛋白Fp1（Ferroportin）、膜铁转运辅助蛋白HP（Hephaestin）mRNA表达的影响采用实时定量荧光PCR法测定心理应激组和对照组大鼠皮层、海马以及纹状体内膜铁转运蛋白Fp1、膜铁转运辅助蛋白HP的mRNA表达水平。两组各取5只大鼠的皮层、海马和纹状体组织,按照试剂说明书用Trizol试剂抽提组织的总RNA,用10个单位的DNase I在37℃下处20ug RNA 30min。纯化后,RevertAid^TMFirst Strand cDNA synthesis Kit逆转录为cDNA。将1ul的cDNA加入含有10×PCRbuffer 2.5ul,25mM Mg²+3.0ul,10mM dNTP mixture 0.5ul,5uM Taq DNA polymerase0.5ul,10×SYBR-green I荧光染料0.7ul,5uM上下游引物2.0ul和DNAase freewater 12.8ul.反应体系中,总体积为25ul。引物由软件Primer Premier5.0设计。2.3心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内内膜铁转运蛋白Fp1（Ferroportin）、铁蛋白Fn（Ferritin）含量的影响Western blot法测定实验组和对照组大鼠皮层、海马以及纹状体内Fp1以及Fn的含量。取含50ug蛋白的裂解液经10%非变性SDS—PAGE电泳分离后,电转移至硝酸纤维素膜。膜用脱脂奶粉室温封闭2h后,分别与1:1000兔抗人铁蛋白抗体、1:2000兔抗小鼠Fp1抗体、和1:2000的β-actin抗体4℃孵育过夜。TBST洗膜3次后,与1:5000辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1 h。用ECL检测试剂检测膜上蛋白质,并用Quantity One软件进行条带分析。3.心理应激大鼠脑细胞铁储存蛋白和铁释放蛋白改变机制的探讨3.1实验动物分组及模型制作:同前3.2心理应激对大鼠脑皮层、海马、纹状体内白介素-6（IL-6）、铁调素Hpec（Hepeidin）mRNA的含量影响采用实时定量荧光PCR法测定心理应激组和对照组大鼠皮层、海马以及纹状体内铁调素Hpec、IL-6的mRNA表达水平。两组各取5只大鼠的皮层、海马和纹状体组织,按照试剂说明书用Trizol试剂抽提组织的总RNA,用10个单位的DNaseI在37℃下处理20ug RNA 30min。纯化后,RevertAid^TM First Strand cDNA synthesisKit逆转录为cDNA。将1ul的cDNA加入含有10xPCR buffer 2.5ul,25mM Mg²⁺3.0ul,10mM dNTP mixture 0.5ul,5uM Taq DNA polymerase 0.5ul,10xSYBR-green I荧光染料0.7ul,5uM上下游引物2.0ul和DNAase free water 12.8ul.反应体系中,总体积为25ul。引物由软件Primer Premier5.0设计。4.数据的统计与处理灌注铁染色图像数据采用image-pro plus 6.0图像分析软件进行灰度分析:铁离子染色阳性颗粒呈深棕黑到黑色,镜检每例组织,在额叶脑皮层次级区,纹状体尾壳核区（CPu区）海马多形细胞层随机选取8个视野,用显微图像分析软件Image-pro plus 6.0测定阳性目标的平均灰度值、视场平均灰度值、面积密度,换算成阳性单位（positive unit,PU）,以PU值大小代表阳性产物表达的多少。同时观察各部位细胞形态。Western-blot蛋白条带数据扫描为Tiff格式图像,QuantityOne一维胶分析软件进行灰度分析得到相对浓度;实时荧光定量数据通rotor-gene6.0.14 software用2^△△CT方法得到相对浓度。实验数据采用SPSS13.0统计软件包进行。采用两独立样本t检验进行数据分析,实验数据以平均数±标准差（[x]±S）表示,P<0.05表示有统计学意义。结果1、心理应激对大鼠脑组织非血红素铁含量的影响1.1心理应激对大鼠大脑皮层、海马、纹状体非血红素三价铁（NHF III）影响。心理应激大鼠脑皮层、海马内NHF III染色较对照组显著升高（P<0.05）,纹状体内NHF III染色未见明显改变。海马CA1,CA2区神经元及其周围明显NHFIII染色增强,神经元细胞的数目减少。在侧脑室前角与周围额叶皮层之间大量NHF III密集。1.2心理应激对大鼠大脑皮层、海马、纹状体非血红素二价铁（NHF II）的影响心理应激组大鼠皮层、海马、纹状体内NHF II染色较对照组显著升高,（P<0.05）。海马CA1,CA2区可见NHF II染色增强伴有神经元细胞的数目减少和结构松散。2.心理应激对大鼠脑铁储存和释放蛋白的影响2.1心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体Fp1、HPmRNA表达的影响实时荧光定量PCR结果显示心理应激组大鼠皮层及海马内Fp1 mRNA含量较对照组显著降低（P<0.05）,心理应激组纹状体内Fp1 mRNA含量较对照组有显著增加（P<0.05）;心理应激组大鼠皮层、海马内HP mRNA含量较对照组明显降低（P<0.05）。纹状体内HP mRNA含量较对照组没有明显改变。2.2心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内Fp1、Fn含量的影响Western-blot结果显示心理应激组大鼠皮层及海马内Fp1含量在较对照组比较显著降低（P<0.05）;纹状体内Fp1含量较对照组有增高趋势无统计学意义（P>0.05）。心理应激组大鼠皮层、海马内Fn含量较对照组比较显著下降（P<0.05）。纹状体内Fn含量较对照组有增高趋势,无统计学意义（P>0.05）。3.心理应激引起大鼠脑铁储存和释放蛋白表达变化的机制探讨3.1心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体内Hpec mRNA的影响实时荧光定量PCR结果显示:（1）正常情况下（未受到任何刺激）大鼠的皮层、海马和纹状体内都有Hepcidin mRNA的表达。皮层Hepcidin mRNA的表达丰度比海马和纹状体显著高,大约20-100倍。（2）心理应激组大鼠皮层HepcidinmRNA较对照组显著升高（P<0.05）,海马Hepcidin mRNA较对照组有降低趋势（P>0.05）,纹状体较对照组没有变化。3.2心理应激对大鼠皮层、海马以及纹状体IL-6表达的影响心理应激大鼠皮层、海马、纹状体内IL-6 mRNA较对照组显著升高（P<0.05）结论本研究通过整体动物实验发现:1.灌注铁染色法结果显示,心理应激组大鼠皮层、海马内NHF III含量和NHFII含量显著升高,纹状体内NHF II含量升高但NHF III没有明显改变。铁离子在皮层、海马特定部位大量沉积,海马CA1,CA2区可见神经元神经元细胞数目减少。表明,心理应激可以导致非血红素结合铁在大鼠部分脑区含量增加。而二价铁离子升高而产生的过多的羟自由基可能是海马CA1,CA2区可见神经元神经元细胞数目减少的原因之一。2.心理应激组大鼠皮层和海马内的Fn含量和HP mRNA表达减少,神经细胞内亚铁氧化酶减少（Fn的H链和HP）,进而导致二价铁离子转化为三价铁离子受到影响,细胞内低分子量铁池扩大,二价铁离子增多。另一方面,增多的二价铁离子不能及时被氧化为三价铁离子而进入铁蛋白存储或进入其他细胞器利用,只能通过自发氧化形成三价铁离子,最终异常沉积于细胞内。上述机制可能是大鼠皮层和海马内的二价铁离子增多的原因。3.心理应激可导致皮层、海马神经元和神经胶质细胞的铁释放蛋白Fp1减少,同时伴有膜铁转运蛋白辅助蛋白HP减少。表明,脑细胞内的铁释放蛋白受到影响而引起铁排除减少,也可能是神经细胞内铁沉积的原因之一。4.心理应激导致海马、皮层、纹状体内细胞因子IL-6 mRNA的表达增多,皮层内Hepc mRNA表达增多。结合国内外相关研究结果,提示心理应激情况下IL-6表达的增加可能是脑皮层的Hepc mRNA表达增加的原因之一。综上所述,本研究结果提示,心理应激可能通过上调炎性细胞因子IL-6mRNA的表达,调节脑皮层Hepc表达增加,增高的Hepc同其受体-脑细胞胞膜上Fp1结合,引起内陷,降解,细胞内的铁释放减少,而亚铁氧化酶膜铁转运辅助蛋白HP的减少加剧了这一过程。Fn和HP的减少引起神经细胞内二价铁离子增多,铁储存的障碍,进而引起细胞内氧化应激的加强,可能是海马内CA1,CA2区可见神经元神经元细胞数目减少的原因。因此,我们认为,应激作为一个全身性神经—内分泌—机体免疫网络,在对抗外界不良刺激的同时,也影响了机体内环境稳定,包括铁代谢稳定。而铁代谢紊乱所导致的脑细胞功能和结构损伤,可能是过度应激后造成健康危害的原因之一。