绿色广谱生物杀虫剂多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的次生代谢产物,它具有高效、低毒、低残留和对环境友好等优点。本课题主要目的就是运用溶剂萃取法和树脂吸附法从发酵液中提取多杀菌素,确定较为合理的工艺方法和参数以及分离纯化工艺路线。 首先,本文建立了关于多杀菌素的快速定量分析检测方法,包括薄层层析法和高效液相色谱法。其中建立的高效液相色谱法具有快速、准确等特点,适用于测定发酵液及各种分离过程中的多杀菌素的含量。其最佳色谱条件如下:色谱柱:碳十八烷基硅胶键合柱;流动相:甲醇∶乙腈∶水(含0.05%乙酸铵)=49∶49∶2;检测波长:246nm;流速:1ml/min;进样量:10μl;柱温:室温。 在溶剂萃取法中,优化后的条件为:发酵液调至pH9.0,加入等体积丙酮,浸提8h,离心后取上清液,经减压浓缩后,再以等体积的乙酸乙酯萃取三次,再次浓缩到1/3的原体积时,用0.2mol/L的酒石酸溶液反萃取,得到的水相调pH为9.0时析出固体,真空干燥得到多杀菌素成品。 在树脂吸附法研究中,筛选出非极性的XAD-4树脂作为吸附剂,优化后的吸附条件为:pH值为11;吸附流速为1/6(1/min);加入2%氯化钠(W/V);吸附量可达1.09×10~4μg/ml湿树脂。优化后的洗脱条件:采用梯度洗脱的方式,以丙酮为洗脱剂,低浓度区内(0～70%)大量杂质及色素被洗脱:高浓度区(70%～95%)内有效成分被洗脱,伴有少量杂质和色素。 结果表明:溶剂萃取法的回收率为68.27%,纯度达91%;树脂吸附法的回收率64.27%,纯度95%。 得到的精制品与多杀菌素标准品的质谱图比较表明,两者为同一物质。 另外,室内生物测定结果表明:本品对几类分别属于鳞翅目、双翅目、缨翅目鞘翅目、同翅目的试虫都有很好的生物活性。