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背景:白癜风是CD8+T细胞介导的自身免疫性皮肤病。自身反应性的CD8+T细胞特异杀伤表皮黑素细胞,最终导致皮肤色素脱失。其中,IFN-γ是CD8+T细胞招募和发挥效应功能的必要因素。白癜风发病率较高,占世界人口的0.5%至2%。该病影响容貌,给患者造成很大的心理压力,极大影响其生活质量。然而,目前该病的主要治疗方法,包括局部或全身使用皮质类固醇、局部使用钙调磷酸酶抑制剂、以及光疗等,均存在不同程度的局限性,如疗程长、有效率低、不良反应大、费用高昂等,无法满足患者需求。因此,进一步探索更安全、高效和低成本的治疗策略,是目前白癜风研究中亟待解决的问题。CD8+T细胞的效应功能与细胞代谢有着紧密的联系。静息态的T细胞代谢需求较低,仅通过低水平的线粒体驱动的氧化磷酸化（OXPHOS）产生ATP进行供能即可维持稳态。激活后的CD8+T细胞的OXPHOS水平升高,其糖酵解速率逐步增强。完全分化的CD8+T效应细胞可同时利用糖酵解和OXPHOS来满足其能量和生物合成的需求,以发挥其效应功能。我们前期研究发现,白癜风患者来源的CD8+T细胞表达效应分子IFN-γ、毒性标志物Granzyme B和Perforin明显增加。Czarnowicki等人发现,白癜风患者CD8+T细胞中IFN-γ+细胞比例显著高于健康对照。这些结果表明白癜风患者CD8+T细胞的功能呈亢进状态,同时也提示白癜风自身反应性的CD8+T细胞的代谢可能发生异常改变。以往有研究初步提示CD8+T细胞代谢可能在白癜风发病中发挥重要作用。细胞程序性死亡蛋白1（PD-1）可以抑制T细胞糖酵解的诱导,并介导其线粒体代谢的抑制,而抗PD1的抗体pembrolizumab可诱发患者罹患白癜风并加重其疾病表型。具有激活糖酵解功能的缺氧诱导因子1α（Hif-1α）在白癜风患者外周血的CD8+T细胞中表达水平升高。Chatterjee等人发现,雷帕霉素可靶向抑制具有调控T细胞代谢作用的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白m TOR,同时也可抑制白癜风小鼠模型的疾病进展。这些线索强烈提示:CD8+T细胞的代谢失衡介导白癜风自身免疫发病,纠正细胞代谢可用于治疗白癜风。目的1.利用白癜风动物模型及临床样本明确CD8+T细胞代谢特征。2.利用白癜风动物模型探讨靶向CD8+T细胞代谢干预在白癜风疾病治疗中的作用。方法1.建立依赖于内源性自身反应性CD8+T细胞攻击表皮黑素细胞的白癜风小鼠动物模型,利用whole-mount染色、皮肤流式及大体拍照脱色定量分析完善其疾病评价体系。2.收集并利用磁珠分选患者外周血及白癜风小鼠模型脾脏来源的CD8+T细胞,利用Seahorse XF能量代谢检测系统明确其整体代谢特征;利用流式测定IFN-γ后明确其功能特征。3.体外实验初步说明代谢调节剂对CD8+T细胞的作用:收集白癜风小鼠脾脏来源的CD8+T细胞,在特定的代谢调节剂干预后利用Seahorse XF技术检测其细胞代谢,并利用流式和ELISA检测其功能。4.体内实验说明代谢调节剂对白癜风进展及复色的影响。利用Seahorse XF技术检测体内使用代谢调节剂后CD8+T细胞的代谢情况,利用whole-mount染色和皮肤流式明确小鼠尾部表皮中黑素细胞存活和CD8+T细胞浸润情况。大体拍照后行脱色程度定量分析明确体内使用代谢调节剂对尾部脱色的具体影响。5.利用临床样本行代谢调节剂体外干预,利用流式检测说明代谢调节剂对CD8+T细胞的功能影响。结果1.本课题所用白癜风小鼠模型具有类似人体白癜风的大体及病理特征:利用whole-mount染色明确不同时间点小鼠模型尾部的动态特征,发现本动物模型病理上表现为一种表皮CD8+T细胞浸润进行性加重及对应部位黑素细胞进行性缺失的特点;尾部大体脱色在早期呈现为一种“微观脱色”现象,即微观病理发现黑素细胞缺失,但大体并未见明显脱色,类似于白癜风患者亚临床脱色,而在后期（白癜风诱导第84天）,白癜风小鼠尾部出现明显肉眼可见的脱色白斑,且肉眼可见的脱色范围与微观病理黑素细胞缺失的部位相对应;利用皮肤流式对白癜风小鼠后期（第84天）表皮CD8+T细胞的浸润情况量化分析发现,白癜风小鼠尾部表皮的CD8+T细胞占比远高于正常小鼠,既与小鼠whole-mount染色结果一致,也与临床白癜风患者的病理特点相吻合。2.白癜风小鼠脾脏来源的CD8+T细胞呈现高代谢及和功能亢进状态:利用Seahorse XF技术实时检测其活细胞代谢发现,白癜风小鼠（第84天）来源的CD8+T细胞的OCR及相应的ECAR水平显著高于正常对照,即其线粒体代谢及糖酵解水平均显著升高,整体呈现高代谢状态。流式检测其功能发现,白癜风小鼠来源的CD8+T细胞IFN-γ+的比例也显著升高,与其整体高代谢水平相呼应。3.体外给予相应代谢调节剂可纠正白癜风小鼠CD8+T细胞的高代谢及功能亢进:二甲双胍（Met）和2-脱氧葡萄糖（2DG）是经典的代谢调节剂,前者通过抑制线粒体复合体I来抑制细胞线粒体代谢,后者则通过竞争抑制己糖激酶抑制细胞的糖酵解。体外利用代谢调剂干预后发现:Met和2DG联用可抑制白癜风小鼠（第84天）来源的CD8+T细胞异常升高的线粒体代谢和糖酵解水平,纠正其高代谢。同时,也可显著抑制其IFN-γ的表达和分泌,纠正其异常亢进的功能。值得一提的是,Met和2DG联用无论在纠正白癜风小鼠CD8+T细胞代谢还是抑制其功能方面都具有协同作用。4.在白癜风小鼠发病早期给予体内代谢调节剂干预,可抑制其疾病进展:通过从发病早期（第28天）开始给予白癜风小鼠代谢调节剂Met和2DG联用干预,后期（第84天）可见其体内的CD8+T细胞的异常线粒体代谢和糖酵解水平均被纠正,且尾部脱色程度显著减轻,甚至未见明显脱色;而Met或2DG单用干预后的白癜风小鼠脱色程度未见明显减轻。Whole-mount染色结果也发现Met和2DG联用干预后白癜风小鼠尾部表皮黑素细胞未见明显缺失,而CD8+T细胞浸润程度显著减轻,后续皮肤流式也进一步证实了该结果。5.在白癜风小鼠发病后期（尾部已有明显肉眼可见脱色）给予体内代谢调节剂干预,可诱导小鼠复色,逆转疾病表型:从第12周（即第84天）开始给予白癜风小鼠代谢调节剂Met和2DG联用干预,在第28周时可见其尾部出现明显的点状或片状复色现象,whole-mount染色结果进一步证实了其表皮黑素细胞出现了一定程度的再生,而CD8+T细胞在表皮中呈零星分布,皮肤流式结果也证实了代谢干预后的白癜风小鼠尾部表皮CD8+T细胞浸润程度显著减轻。6.白癜风患者来源的CD8+T细胞也具有类似的高代谢特征,且体外使用相应代谢调节剂可纠正其异常亢进的功能:收集6例白癜风患者及对应的健康对照外周血并分选其CD8+T细胞,发现白癜风患者来源的CD8+T细胞的代谢水平（包括线粒体代谢和糖酵解）高于正常对照,且体外利用Met+2DG也可有效抑制白癜风患者CD8+T细胞的功能。结论白癜风发病系自身反应性的CD8+T细胞特异杀伤黑素细胞所致。我们的研究首次发现,白癜风CD8+T细胞呈现高水平的线粒体代谢和糖酵解,且CD8+T细胞高代谢通过调控其效应功能在白癜风发病及维持中发挥重要作用。使用代谢调节剂Met和2DG分别纠正白癜风小鼠CD8+T细胞异常的线粒体代谢和糖酵解,不仅抑制了其进行性的尾部脱色,也成功逆转了已经脱色的小鼠尾部的疾病表型,诱导白斑复色。本研究初步探索了CD8+T细胞代谢在白癜风发病中的重要作用,提出双重抑制CD8+T细胞糖酵解和线粒体代谢使代谢和功能正常化是白癜风的有效治疗策略。