第一部分叶酸靶向的载SIK2 si RNA和anti-mi R21长循环纳米聚合物的合成及性能检测目的制备一种共载盐诱导激酶2(SIK2)小干扰RNA(si RNA)和反义mico RNA-21的靶向脂质-聚乳酸羟基乙酸(PLGA)复合纳米粒(Nanopolymer,NP)(Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21),对纳米粒的脂质/PLGA成分进行优化,并检测其粒径、电位、体外稳定性、RNA载量及体外释放效力等性能。方法首先制备叶酸(Folate,FA)靶向的脂质-聚乳酸羟基乙酸纳米复合物(Fa LPHNP)并鉴定其理化性质。采用改良的两步自组装法制备叶酸靶向纳米聚合物Fa LPNP,非靶向纳米聚合物LPHNP,以及包载两种核酸:SIK2 si RNA及anti-mi R21的靶向纳米聚合物(Fa LPHNP@si SIK2/mi R21)。同时检测三种纳米聚合物的理化性质,包括形态结构、粒径、电位。室温下,分别在PBS及含胎牛血清PBS溶液中,选取不同时间点观察纳米粒形态、粒径、电位的变化,分析其稳定性。使用多功能酶标仪检测RNA载药量,使用薄膜透析法测定RNA释放效力。使用琼脂他凝胶电泳检测,在RNA酶存在的情况下,评价Fa LPNP对RNA有保护其被RNA酶快速降解的作用。结果使用自组装方法制备的纳米聚合物呈乳白色。扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察到该纳米聚合物为球形结构,大小均一,分散度好。通过透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察到该纳米粒具有双层脂质外壳。通过马尔文粒径检测仪测得Fa LPNP@si SIK2/mi R21平均粒径169.25±21nm,平均电5.28±3 m V。在PBS溶液中4°C放置15天,Fa LPHNP@si SIK2/mi R21粒径和电位未发生明变化,证明该纳米粒在稳定性良好。琼脂糖凝胶电泳显示,在有RNA酶(RNase)存在的情况下,Fa LPHNP对RNA有防止被RNA酶快速降解的作用。测得的Fa LPHNP载药(RNA)量为包封率si SIK2/anti-mi R21:82.33±4/81.27±7%。体外释药显示缓释效果。结论本实验通过改良两步自组装方法制备了Fa LPNP@si SIK2/anti-mi R21纳米聚合物,其形态规则,大小分布均一,体外性质较稳定,负载SIK2 si RNA和anti-mi R21,具有高载药量,以及体外缓释能力。第二部分载SIK2 si RNA和anti-mi R21复合纳米粒在超声-微泡介导下对卵巢细胞靶向性、治疗效果评估(体外实验)目的观察Fa LPHNP对三种上皮性卵巢癌细胞:OVCAR3、SKOv3及A2780中的靶向性,以及Fa LPNP@si SIK2/mi R21在超声-微泡介导下结合紫杉醇(Paclitaxel,PTX)对卵巢癌细胞活力、凋亡及迁移的影响。方法首先制备叶酸修饰纳米粒(Fa LPHNP)及非叶酸修饰纳米粒(LPHNP)。通过激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)分别观察载有Cy3红色荧光染料标记的si RNA的纳米粒与DAPI染色的上皮性卵巢癌细胞(OVCAR3、SKOv3及A2780)共定位情况,同时使用流式细胞术检测各实验组(a.超声-微泡介导的Fa LPHNP细胞转染;b.无超声-微泡介导的Fa LPHNP细胞转染;c.LPHNP细胞转染)转染效率。使用CCK8方法观察不同浓度SIK2 si RNA(5n M,10n M,20n M,50n M,100n M,150n M)以及是否存在anti-mi R21的情况下与OVCAR3、SKOv3及A2780细胞共孵育后细胞活力的变化。并根据该试验优化SIK2 si RNA治疗浓度。进一步通过CCK8方法验证在超声-微泡介导下使用联合Fa LPNP@si SIK2/antimi R21及紫杉醇对OVCAR3、SKOv3及A2780细胞进行共孵育,观察48小时对细胞活力的影响。同时使用rt-PCR观察各细胞中SIK2m RNA及mi R21表达水平的变化。以及通过Western Blotting试验观察经上述处理后的OVCAR3、SKOv3及A2780细胞中SIK2蛋白水平,以及mi R21抑制的下游蛋白PDCD4的表达水平变化。通过细胞伤口愈合试验观察,上述实验对三种上皮性卵巢癌细胞迁移性的影响,以及通过流式细胞术观察超声-微泡介导Fa LPNP@si SIK2/anti-mi R21纳米粒联合PTX处理对卵巢癌细胞凋亡的影响。结果激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察到a).载有相同浓度红色荧光Cy3标记的si RNA纳米粒(Fa LPHNP@Cy3-si RNA)在超声微泡介导转染组,较b).非超声-微泡介导的(Fa LPHNP@Cy3-si RNA)组以及c).非靶向(LPHNP@Cy3-si RNA)组相比,a组红色荧光更多的定位在细胞核周围胞质中。同时将以上三组细胞通过流式细胞术测得,超声微泡介导Fa LPHNP@Cy3-si RNA转染组,转染效率明显高于其他实验组(P<0.01)。将载有不同治疗浓度SIK2 si RNA与Fa LPHNP共孵育后观察到OVCAR3、SKOv3及A2780细胞活性呈浓度依赖性降低趋势。优化效治疗浓度的SIK2 si RNA+anti-mi R21合成Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21后,观察到超声-微泡介导的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21联合PTX处理的OVCAR3、SKOv3及A2780细胞其活性较其他实验组显著降低(P<0.01)。通过rt PCR检测观察到超声-微泡介导的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21在OVCAR3、SKOv3及A2780细胞转染48小时后,对上述三种细胞中内源性SIK2m RNA及内源性mi R21水平降低最显著(p<0.01)。同时,通过Western Blot试验结果观察到经超声-微泡介导的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21转染48小时后,OVCAR3、SKOV3及A2780细胞内SIK2蛋白水平明显降低,mi R21抑制的靶蛋白之一PDCD4表达水平显著增高,(p<0.01)。细胞划痕试验(细胞伤口愈合试验)结果显示经超声-微泡介导的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21细胞转染联合PTX处理的实验组,观察0~48小时的细胞划痕愈合面积最小(p<0.01);同时流式细胞术观察到超声-微泡介导的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21细胞转染联合PTX处理的实验组细胞早期凋亡最显著(p<0.01)。结论制备的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21纳米粒在超声-微泡介导下具有主动靶向卵巢癌细胞(OVCAR3、SKOv3及A2780)的能力,实现了超声-微泡介导的像卵巢癌细胞靶向递送RNA类药物。并对卵巢癌细胞内靶基因水平及相应蛋白的合成均明显的干预作用。较单独PTX处理细胞组,超声-微泡介导的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21联合紫杉醇(PTX)处理组,显著降低了上述三种上皮性卵巢癌的迁移和凋亡,初步实现该RNA药物递送平台对化疗药物紫杉醇(PTX)对卵巢癌细胞OVCAR3、SKOv3和A2780的增敏作用第三部分 超声-微泡介导的载SIK2 si RNA/anti-mi R21的Fa LPHNP纳米粒在荷瘤小鼠体内分布、生物安全性、靶向性及治疗效果评价目的观察超声-微泡介导的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21体内递送靶向效率、体内生物分布、血液中半衰期、生物相容性及联合PTX的对OVCAR3荷瘤小鼠的治疗效果观察。方法首先通过使用人类外周血单核细胞(PBMC)与不同浓度单纳米粒Fa LPHNPs(50n M,200n M)以及不同浓度载核酸的纳米粒Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21(50n M,200n M)共孵育24小时后,观察其诱导细胞因子IL-6和TNF-α分泌水平,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理的PBMC细胞组作为阳性对照,评价纳米粒免疫原性。为了研究纳米粒在体内的生物相容性,经Balb/c小鼠尾静脉分别注射不同浓度的纳米粒(Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21):5mg/ml,10mg/ml。注射后第1,4,7天分别取小鼠肝脏和肾脏组织进行HE染色;第7天分别收集小鼠血液进行CK、LDH-L(心功能),CRE、BUN(肾功能)和AST、ALT、TBi L(肝功能)、以及细胞因子IL-6、TNF-α。为了验证超声微泡介导的纳米粒在体内的分布以及肿瘤部位的富情况。我们首先制备了叶酸修饰的Di R标记的靶向纳米粒(Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21)及非叶酸修饰纳米粒(LPHNP@si SIK2/antimi R21)。建立Balb/c-OVCAR3卵巢癌细胞荷瘤裸鼠模型,当经皮下种植的肿瘤体积长至约100 mm3时,经小鼠尾静脉分别注射a).Di RFa LPHNP@si SIK2/anti-mi R2+Sono VueTM微泡,使用超声诊断探头在裸鼠肿瘤部位进行皮下肿瘤超声造影呈像,检测Sono VueTM脂质微泡造影剂肿瘤局部敏感性,接着使用超声治疗探头照射肿瘤部位以定向破坏脂质微泡;b).无超声-微泡介导的Fa LPHN@si SIK2/anti-mi R2经Balb/c裸鼠尾静脉注射组;c).非靶向纳米粒LPHNP。以上三组Balb/c裸鼠经尾静脉注射后24小时、48小时分别通过Xenogen IVIS生物发光成像系统采集荧光图像,分析肿瘤及其他重要器官荧光信号强度。24小时后处死部分小鼠,分别取小鼠肿瘤、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺组织通过Xenogen IVIS生物发光成像系统采集离体荧光图像,分析各实验组肿瘤组织及其他重要脏器组织荧光强度。为了进一步验证纳米粒在肿瘤部位富集情况,荷瘤小鼠分四组,经尾静脉注射1)超声-微泡介导Fa LPHNP@Cy3-si RNA;2)Fa LPHNP@Cy3-si RNA;3)LPHNP@Cy3-si RNA以及4)PBS作为阴性对照。处理后24小时处死小鼠,取肿瘤组织冰冻切片通过荧光显微镜分析不同实验组肿瘤组织的红色荧光强度。为了分析纳米粒在体内代谢特点,我们将载有Cy3标记的si RNA纳米粒(Fa LPHNP@Cy3-si RNA)和裸的Cy3标记的si RNA经小鼠尾静脉注射后,不同时间点收集小鼠血液使用Bio Tek多功能酶标仪检测Cy3荧光,分析Fa LPHNP@Cy3-si RNA及裸的Cy3-si RNA在小鼠体内的代谢动力学。为了观察超声介导的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21体内递送联合紫杉醇在小鼠卵巢癌模型中的治疗效果。首先制备靶向纳米粒Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21及非靶向纳米粒LPHNP@si SIK2/antimi R21。建立Balb/c-OVCAR3皮下种植瘤小鼠,待肿瘤长到约75mm3时进行不同处理组治疗。我们将小鼠随机分为七组:1.对照组(生理盐水);2.紫杉醇组;3.非靶向纳米粒LPHNP@si SIK2/anti-mi R21组;4.非靶向纳米粒LPHNP@si SIK2/anti-mi R21联合超声-微泡(US-MB)介导递送组;5.靶向纳米粒Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21组;6.非靶向纳米粒LPHNP@si SIK2/anti-mi R21联合超声-微泡(US-MB)介导递送组;7.靶向纳米粒Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21联合超声-微泡(US-MB)介导递送+紫杉醇治疗组。其中1、2、3、5组仅分别经小鼠尾静脉注射生理盐水、紫杉醇、非靶向纳米粒以及靶向纳米粒;4、6、7组小鼠先经尾静脉注射200 ul Sono VueTM微泡后再分别给予纳米粒和/活紫杉醇注射,同时予以超声探头辐照肿瘤部位获得肿瘤组织成像后靶向破坏微泡(参数:1 MHz,1.8 W/cm2,50%占空比,持续时间=10s)。治疗期间监测小鼠体重、肿瘤体积大小,生存期等。治疗终点处死小鼠,取肿瘤组织进行TUNEL、PCNA免疫荧光染色检测肿瘤细胞增殖和凋亡。结果人外周血单核细胞与不同浓度Fa LPHNP和Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21纳米粒共孵育24小时后收集细胞培养液进行细胞因子检测发现,治疗浓度(50n M)纳米粒对IL-6、TNF-α的影响可忽略,高浓度纳米粒(200n M)引起的轻-中度IL-6、TNF-α升高,但仍显著低于阳性对照组LPS诱导的IL-6和TNF-α急剧升高(超过试剂盒检测限),(P<0.001)。证实了纳米粒具有低免疫原性特征。在体内实验中,在Balb/c小鼠尾静脉注射不同浓度Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21(5mg/ml,10mg/ml),第1,4,7天取小鼠肝脏、肾脏组织H&E染色均未发现明显异常。提示该治疗方式的生物安全性良好。在第7天收集小鼠血清CK、LDH-L、CRE、BUN、和AST、ALT、TBi L检测无统计学差异。经小鼠尾静脉注射Cy3标记的游离si RNA后30分钟采血几乎检测不到Cy3荧光,而注射Fa LPHNP包裹的Cy3-si RNA组,计算纳米粒体内半衰期约8.5小时。证明该纳米粒能保护核酸(基因)药物在血液中不被快速降解,为基因治疗提供了基础。在体内靶向实验中,超声-微泡介导的Fa LPHNP@si SIK2/antimi R21体内递送,通过超声介导的声孔效应(Sonoporation)、高通透性和滞留效应(Enhanced Permeability and Retention,EPR)及主动靶向性在肿瘤部位逐渐富集,小鼠活体荧光观察到肿瘤部位荧光信号强度随时间推移而增加。给药24小时后达到高峰,随后逐渐减弱。在无超声介导的靶向纳米粒租以及非靶向纳米粒租的荧光信号显著低于USMB介导的Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21组。在体内卵巢癌治疗观察中,单纯PTX组、LPHNP@@si SIK2/antimi R21组对肿瘤抑制作用最小;超声-微泡(US-MB)介导的靶向纳米粒Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21组、US-MB介导非靶向纳米粒LPHNP@@si SIK2/anti-mi R21、无超声介导的靶向纳米粒Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21组对肿瘤生长有一定程度抑制;US-MB介导的靶向纳米粒Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21联合PTX治疗组肿瘤生长收到了完全抑制,该治疗组小鼠总生存期超过58天。肿瘤组织TUNEL免疫荧光染色显示改组肿瘤组织凋亡荧光最高,PCNA肿瘤细胞增殖荧光最低(肿瘤细胞增殖明显被抑制);对照组小鼠生存期平均27天;PTX组、非靶向纳米粒组平均生存期分别为32天和29天;US-MB介导的靶向和非靶向纳米粒治疗组小鼠平均生存期分别为46天和35天。结论超声-微泡介导的靶向纳米粒体内递送Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21,通过超声-微泡声孔效应、EPR效应、以及叶酸主动靶向性,增加了纳米粒在肿瘤部位的富集,促进了核酸药物的释放。超声-微泡介导Fa LPHNP@si SIK2/anti-mi R21体内递送,增强了PTX的疗效。该治疗方式小鼠体内被证实具有良好生物安全性。