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香蕉枯萎病(Banana vasicular wilt)是由尖孢镰刀菌[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E F.Smith)Snyder et Hansen(anamorph)]引起的一种世界性、毁灭性病害。已报道的香蕉枯萎菌有4个生理小种,我国有1号和4号小种。该病对我国乃至世界的香蕉生产危害极大,而目前还没有一种真正有效的防治方法,因此寻求一种行之有效的方法防治香蕉枯萎病具有重要意义。
本论文研究了从湛江近海海泥中分离筛选得到的海洋细菌TC-1对香蕉枯萎菌的拮抗抑制作用,主要结果如下:
1.海洋细菌TC-1对香蕉枯萎菌有很强的拮抗作用,无菌发酵液对香蕉枯萎菌菌落生长及孢子萌发具有明显的抑制作用。无菌发酵液稀释50倍时,第七天对香蕉枯萎菌生长的抑菌率为55.2%,稀释40倍时孢子萌发的抑制率为92.5%。
2.根据形态和生理学特征、16S rDNA分子鉴定和API鉴定结果,初步鉴定海洋细菌TC-1为枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn1872]。
3.TC-1使病原菌菌丝、孢子和芽管形态发生变化,菌丝顶端或中间呈囊泡状,扭曲、断裂,或细胞原生质外流成空泡;孢子变形,芽管尖端膨大成囊状、变细、崩解。
4.TC-1菌株对立枯丝核菌(R. solani AG-4 SDBC-71)、水稻纹枯菌R. solaniAG-1IA GESD-6)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、辣椒炭疽菌(Colletotrichumcapsici(syd.)Butl)、白地霉(Geotrichum candidum)、华丽腐霉(Pythium splendens)、芝麻枯萎病菌(F. oxysporum Schl.f.sp.sesami(Zap.)Cast)、黑曲霉(Aspergillus nige)有明显的抑菌作用,抑菌带宽分别为2.5mm、7.2mm、14.7mm、9.5mm、8.5mm、9.9mm、7.8mm、8.2mm,带宽最大的是玉米小斑病菌。无菌发酵液对香蕉枯萎菌1号小种(F. oxysporum f.sp.cubense Snyder et Hansen Race1)、黑根霉(Rhizopusnigricans)、黑曲霉(Aspergillus nige)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、芝麻枯萎病菌(F. oxysporum Schl.f.sp.sesami(Zap.)Cast)、辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici(syd.)Butl)有较强的抗菌活性,抑菌圈直径分别为17.0mm、16.8mm、14.8mm、14.4mm和26.2mm,对辣椒炭疽病菌的抑菌圈直径最大。
5.从6种培养基中筛选出最利于TC-1菌株产抗菌活性物质的培养基为BPDB液体培养基,抑菌圈直径21.5mm;采用正交试验优化BPDB培养基配方,得到最优配方为:马铃薯200g,葡萄糖20g,牛肉膏20g,玉米粉7g、蛋白胨7g,蒸馏水1000mL,pH自然,抑菌圈直径23.0mm;采用正交试验优化TC-1产抗菌活性物质的发酵条件,得到最佳培养条件为:装瓶量40%,培养温度27℃,初始pH自然,发酵时间72h,摇床转速200rpm,在该条件下培养得到的无菌发酵液形成的抑菌圈直径为24.0mm。
6.在pH5~9的范围内,无菌发酵液的抑菌效果没有显著差异,表明酸碱对发酵液内抗菌活性物质的抗菌活性没有影响;经28℃、60℃和100℃不同时间的处理,随着温度的升高和时间的延长,抑菌圈直径逐渐减小,经121℃处理30min后的抑菌圈直径仍达17.9mm,表明发酵液中的抗菌活性物质耐高温。日光和灯光照射对TC-1发酵液的抑菌活性无影响。TC-1发酵液长时间存放的抑菌活性稳定,经100天4℃存放的抑菌圈直径为16.7mm。
7.茚三酮检测和双缩脲反应为阳性,表明抗菌粗提物可能为多肽、蛋白质或氨基酸类物质。SDS-PAGE电泳结果显示抗菌粗提物中含有6种蛋白,分子量分别为18.0KD、19.0KD、23.5KD、30KD、57KD和75KD。抗菌粗提物内的抗菌活性物质溶于丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇,其中丙酮提取粗提物的效果最好,氯仿、乙酸乙酯、甲苯和乙醚的提取液无抑菌效果,表明抗菌活性物质不溶于这些有机物。Ca2+、K+、Ba2+和Zn2+离子对抗菌粗提物的抑菌活性没有影响。紫外线照射对粗提物的抑菌效果没有影响,表明TC-1产生的抗菌活性物质抗紫外线。