肿瘤基质细胞是肿瘤微环境的重要组成部分,在肿瘤发展过程中和肿瘤细胞相互作用并建立一系列“对话”机制。通过肿瘤-基质细胞之间持续的对话,肿瘤细胞不断改造微环境,使之成为适合自身发展的肿瘤微环境。癌相关成纤维细胞作为一种激活状态的成纤维细胞,是参与肿瘤-基质对话的最重要的基质细胞。微囊泡是由细胞分泌的双层囊状膜结构,属于细胞外囊泡的一种,能够通过靶向传递丰富的内容物介导细胞间通讯,在肿瘤-基质对话中具有重要的调控作用。能量代谢重编程是肿瘤的重要特征性标志之一,肿瘤细胞和基质细胞均进行代谢重编程,通过代谢对话形成有利于肿瘤进展的代谢状态,适应营养相对缺乏的肿瘤微环境,促进肿瘤的进展。口腔鳞癌是头颈部最常发生的恶性肿瘤之一,容易发生侵袭和颈部淋巴结转移,口腔鳞癌中丰富的基质细胞在口腔鳞癌的发生发展过程中发挥着重要的作用。在本研究中,我们证明了口腔鳞癌通过微囊泡调控基质细胞糖酵解重编程促进自身进展的新机制:口腔鳞癌细胞通过分泌并传递微囊泡,将正常成纤维细胞转变为癌相关成纤维细胞,并通过激活ERK1/2信号通路引起Caveolin1（CAV1）的降解;CAV1的降解介导成纤维细胞糖酵解重编程,使成纤维细胞进行有氧糖酵解,摄取更多葡萄糖并分泌更多的乳酸,并通过MCT4/MCT1轴介导的乳酸穿梭供应给肿瘤细胞,满足肿瘤细胞能量和合成代谢的需求,促进口腔鳞癌的进展。通过微囊泡介导的成纤维细胞“反Warburg效应”,口腔鳞癌建立了一种基于MCT4/MCT1轴的“成纤维细胞-肿瘤细胞代谢组合”,使口腔鳞癌进行肿瘤-基质代谢对话并最终促进口腔鳞癌的进展。该研究为靶向肿瘤微囊泡诱导的CAV1降解及其调控的“成纤维细胞-肿瘤细胞代谢组合”治疗口腔鳞癌提供了潜在的新策略。第一部分:肿瘤微囊泡在CAFs激活和糖代谢重编程中的作用研究目的:探讨口腔鳞癌基质细胞是否发生糖酵解重编程,以及肿瘤微囊泡在口腔鳞癌相关成纤维细胞的激活和糖酵解重编程中的作用。方法:分别从健康志愿者和口腔鳞癌患者的组织中提取原代正常牙龈成纤维细胞（HGFs）,原代癌旁正常成纤维细胞（PNFs）和癌相关性成纤维细胞（CAFs）,并用免疫荧光染色进行鉴定;提取口腔鳞癌细胞系来源的肿瘤微囊泡（TMVs）并用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）进行鉴定;用TMVs刺激培养的HGFs,用共聚焦荧光显微镜观查HGFs对TMVs的吸收,并通过CCK-8,细胞凋亡实验检测TMVs对HGFs细胞活性的影响;q RT-PCR和Western Blot检测TMVs刺激的HGFs中癌相关成纤维细胞指标FAP,Tn-c的表达;葡萄糖摄取实验和乳酸检测实验检测原代PNFs,CAFs和TMVs刺激的HGFs的葡萄糖摄取量和乳酸产生量,用TEM观查TMVs刺激的HGFs中线粒体的数量和形态;Western Blot检测原代PNFs,CAFs和TMVs刺激的HGFs中糖酵解相关指标CAV1,GLUT1,PDK1和MCT4的表达。结果:细胞免疫荧光结果显示提取的HGFs,PNFs和CAFs符合成纤维细胞的特点,SEM,TEM和DLS检测结果显示提取的TMVs符合微囊泡的特征;共聚焦荧光显微镜结果显示HGFs可以吸收TMVs,且对TMVs的吸收呈时间依赖性,TMVs被HGFs吸收后能够释放出内容物,被细胞内化利用;CCK-8,细胞凋亡实验显示TMVs刺激的HGFs增殖和凋亡均减弱;q RT-PCR和Western Blot结果显示TMVs刺激的HGFs中FAP和Tn-c表达升高,HGFs向癌相关成纤维细胞方向转化;葡萄糖摄取实验,乳酸检测实验,TEM及Western Blot检测结果显示,CAFs和TMVs处理的HGFs的葡萄糖吸收量和乳酸产生量分别高于PNFs和对照组HGFs,CAFs和TMVs处理的HGFs中CAV1表达降低,GLUT1,PDK1和MCT4表达升高,且TMVs处理的HGFs中线粒体发生肿胀,正常线粒体数量减少,CAFs和TMVs处理的HGFs中有氧糖酵解增强。结论:口腔鳞癌组织中癌相关成纤维细胞有氧糖酵解水平增加,发生糖代谢重编程;口腔鳞癌细胞通过释放并传递微囊泡激活成纤维细胞,使其转变为癌相关成纤维细胞,并增强成纤维细胞的有氧糖酵解,使其发生糖代谢重编程;微囊泡介导的糖代谢重编程可能是通过靶向CAV1实现的。第二部分:肿瘤微囊泡介导CAFs糖代谢重编程的分子机制研究目的:探讨ERK1/2-CAV1通路在成纤维细胞糖代谢重编程中的调控作用,以及微囊泡在ERK1/2信号通路激活中的作用。方法:通过sh RNA技术敲低HGFs中CAV1的表达,利用Western Blot检测敲低CAV1后HGFs中糖代谢相关蛋白GLUT1,PDK1和MCT4的表达,同时检测ERK1/2信号通路的激活情况。用ERK1/2通路的抑制剂U0126预处理HGFs后加入TMVs进行刺激,Western Blot检测U0126对ERK1/2通路的抑制效果及对CAV1和糖代谢相关蛋白GLUT1,PDK1和MCT4表达的影响;检测原代PNFs和CAFs中ERK1/2-CAV1通路的激活情况。Western Blot检测肿瘤细胞和TMVs中p-ERK1/2的表达,并用流式细胞技术检测TMVs对p-ERK1/2蛋白的直接传递作用。结果:Western Blot结果显示,敲低HGFs中CAV1的表达后,HGFs中PDK1,MCT4表达升高,GLUT1表达无明显差异,说明CAV1靶向PDK1和MCT4调控HGFs有氧糖酵解。用U0126抑制ERK1/2通路后,TMVs引起的CAV1降低及PDK1和MCT4表达的增加被逆转,说明抑制ERK1/2通路可以逆转CAV1的降低及CAV1降低增强的有氧糖酵解。流式细胞技术显示TMVs可以直接传递p-ERK1/2蛋白至HGFs并激活ERK1/2信号通路。结论:口腔鳞癌能够通过肿瘤微囊泡的细胞间传递直接水平传递p-ERK1/2蛋白,激活ERK1/2信号通路;激活的ERK1/2信号通路通过下调CAV1的表达增强成纤维细胞中的有氧糖酵解,调控成纤维细胞的糖酵解重编程。第三部分:口腔鳞癌-成纤维细胞代谢对话的分子机制研究目的:探究口腔鳞癌微囊泡介导的成纤维细胞糖代谢重编程在口腔鳞癌进展中的作用,以及微囊泡调控癌-成纤维细胞代谢对话的分子机制。方法:建立肿瘤-成纤维细胞体外共培养模型,通过细胞划痕实验和侵袭实验检测与TMVs预处理的HGFs共培养的口腔鳞癌细胞的迁移和侵袭能力;通过Western Blot检测共培养的口腔鳞癌细胞中MMPs,MCT1和SDHA的表达。利用裸鼠建立体内共培养模型,将口腔鳞癌细胞和HGFs混合后注射至裸鼠皮下形成移植瘤,定期注射TMVs并检测瘤体的生长速度。通过sh RNA技术敲低口腔鳞癌细胞中MCT1的表达,检测MCT1敲低的口腔鳞癌细胞与TMVs预处理的HGFs共培养时迁移和侵袭能力的变化。通过免疫组化染色检测移植瘤和口腔鳞癌组织中CAV1,MCT4和MCT1的表达并分析其相关性。结果:细胞划痕实验和侵袭实验显示TMVs预处理的HGFs在体外增强口腔鳞癌细胞的迁移和侵袭能力;Western Blot结果显示与TMVs预处理的HGFs共培养的口腔鳞癌细胞中侵袭相关的MMPs,乳酸摄取相关的MCT1及线粒体呼吸关键酶SDHA的表达均增加;裸鼠体内移植瘤共培养模型的结果显示,TMVs刺激的HGFs在体内促进口腔鳞癌的生长。敲低口腔鳞癌细胞MCT1的表达可以逆转TMVs预处理的HGFs对口腔鳞癌细胞迁移和侵袭能力的促进作用。免疫组化染色结果显示,TMVs刺激的移植瘤和口腔鳞癌组织的基质细胞中CAV1低表达,MCT4高表达,而基质边缘的肿瘤细胞中MCT1高表达;基质细胞中CAV1的表达和MCT4表达呈负相关,肿瘤细胞中MCT1表达和基质细胞中MCT4表达呈正相关;口腔鳞癌组织中MCT1表达存在异质性,边缘的肿瘤细胞MCT1表达明显低于中心部位的肿瘤细胞。结论:口腔鳞癌微囊泡介导的成纤维细胞糖酵解重编程通过MCT4/MCT1轴为口腔鳞癌细胞提供乳酸,满足口腔鳞癌细胞的能量和物质需求并促进其进展;肿瘤微囊泡通过MCT4/MCT1轴介导的“成纤维细胞-肿瘤细胞代谢组合”促进口腔鳞癌进展。