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银杏叶类黄酮具有重要的药用价值,提高其含量已成为银杏研究的热点与难题。研究表明,采用生理生化途径调控银杏叶类黄酮含量是一种有效的方法;利用植物基因工程技术提高银杏叶类黄酮含量也具有良好的前景。然而,银杏类黄酮生物合成途径在分子水平上的报道还较少。为深入研究银杏类黄酮的合成途径,并为今后利用基因工程技术提高银杏类黄酮含量奠定基础,本文首次克隆并研究了银杏类黄酮合成途径中的两个重要的基因,它们分别是苯丙氨酸解氨酶基因(GbPAL)和花色素合成酶基因(GbANS)。针对生理生化途径,本文研究了5-氨基乙酰丙酸(ALA)处理对银杏叶片类黄酮含量影响,以期为提高银杏叶类黄酮含量提供理论依据。其主要研究内容与结果如下:(1)银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、性质以及表达模式研究。利用RACE技术从银杏中克隆获得一个苯丙氨酸解氨酶基因GbPAL的cDNA和基因组全长(GenBank Accession No. EU071050)。GbPAL基因基因组序列与cDNA序列一样,无内含子。GbPAL基因cDNA全长为2886 bp,含有一个2172 bp的开放阅读框(ORF),编码724个氨基酸。蛋白质同源比对分析表明,GbPAL与其它植物的PAL蛋白高度同源,且包含苯丙氨酸解氨酶所必需的保守氨基酸位点和保守模式。用同源建模的方法得到GbPAL蛋白的三维模型,这个模型与欧芹PAL(PcPAL)的三维结构高度相似。PAL基因的系统进化树分析结果表明,GbPAL与裸子植物的PAL具有更近的亲缘关系。Southern blot结果表明,GbPAL基因属于一个多基因家族。实时定量PCR(real-time PCR)分析表明,GbPAL基因在银杏不同器官中组成型表达,但在茎和叶中的表达相对较高。Real-time PCR分析结果显示,GbPAL基因的表达受UV-B、机械损伤、水杨酸和低温的诱导,暗示GbPAL基因参与了银杏对逆境胁迫的抗性。线性回归分析结果表明银杏叶类黄酮含量与GbPAL基因表达量之间存在显著正相关关系,表明GbPAL基因可能是银杏叶类黄酮合成途径中的关键基因之一。(2)银杏花色素合成酶基因的克隆、功能分析及响应非生物胁迫的表达模式。利用RACE技术首次从裸子植物银杏中克隆得到一个花色素合成酶基因GbANS的cDNA全长(EU600206)和基因组序列(EU600205)。GbANS基因全长cDNA为1441 bp,含有一个1062 bp的ORF,编码354个氨基酸。蛋白序列多重比对结果表明,GbANS蛋白与其它植物的ANS蛋白具有很高的相似性,GbANS存在结合亚铁离子和酮戊二酸的保守位点。GbANS基因含有三个外显子和两个内含子。通过基因组步移的方法获得了GbANS基因的5’侧翼序列,该区域含有包括TATA盒在内的启动子必需元件,序列预测表明,这个区域还含有光、冷、水杨酸、乙烯和脱落酸应答等顺式作用元件。同源建模产生的GbANS三维结构与功能已知的、拟南芥ANS(AtANS)的三维结构一样,具有2-ODD酶特征性的扭曲果冻状结构。类黄酮特异2-ODD酶进化树分析表明,GbANS与其它植物的ANS具有共同的祖先。Southern blot结果显示,GbANS基因属于一个多基因家族。Real-time PCR分析表明,GbANS基因的表达水平在不同器官以及器官不同时期均有差异性,在成熟果中的表达量最高,胚珠和雄蕊,茎和根中未检测到有表达,花青苷在各器官中的含量显示了与GbANS基因器官与发育表达图谱良好的一致性。real-time PCR分析结果显示GbANS基因的表达水平受UV-B、脱落酸、低温、水杨酸、乙烯以及蔗糖上调,这一结果与GbANS基因启动子序列预测分析的结果相吻合,表明GbANS基因可能参与银杏对上述逆境胁迫下的抗性。原核表达的重组GbANS蛋白的分子量大小和通过生物信息学预测的分子量大小相同。Western blot试验结果表明,重组GbANS蛋白的N末端含有6×His标签,说明GbANS基因编码的GbANS蛋白可以在大肠杆菌中正确的表达。利用HPLC分析纯化的重组GbANS蛋白体外酶活性,结果表明重组GbANS蛋白具有两种功能,即(1)催化无色花青素生成花青素,(2)催化二氢槲皮素生成槲皮素。(3) ALA对银杏类黄酮含量的影响。以3年生盆栽银杏实生苗为试材,研究了叶面处理浓度分别为10、100 mg/L的ALA对银杏叶光合作用、叶绿素含量、可溶性糖含量、类黄酮含量、总多酚含量、花青苷、黄酮合成相关的酶(PAL、CHS和CHI)活性的影响。结果表明,在处理后的第4天,相对对照而言,ALA处理的银杏叶的光合速率显著提高,ALA的这种促进作用一直稳定维持到处理后的第16天。ALA处理能显著提高银杏叶的叶绿体和可溶性糖含量,且随着处理时间的延长增幅加大,但对于叶绿体a/叶绿体b的比值无显著性差异。总酚、类黄酮以及花青苷含量在ALA的处理下迅速增加,其增加速率显著高于对照。ALA处理下PAL、CHS和CHI的活性变化与类黄酮含量的变化趋势相似,表明ALA可显著诱导PAL、CHS和CHI的活性。上述处理效果均具有浓度效应,以100mg/L ALA的效果较佳。