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第一部分鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的现象观察目的:探讨鞣花酸(Ellagic acid,EA)对人脑胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)细胞U87、U118细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法:应用CCK-8法检测EA对U87、U118细胞活性的影响;应用克隆形成实验、EdU实验检测EA对U87、U118细胞增殖能力的影响;应用流式细胞术检测EA对U87、U118细胞周期的影响;应用流式细胞术、Hoechst33342/PI双染法检测EA对U87、U118细胞凋亡的影响;应用细胞划痕实验观察EA对U87、U118细胞迁移能力的影响;应用Transwell assay实验观察EA对U87、U118细胞侵袭能力的影响;结果:EA可以抑制人脑GBM细胞U87、U118的细胞活性,其抑制作用呈浓度、时间依赖性,EA处理瘤细胞48h后,U87、U118细胞的IC50分别为91.2μM、98.6μM。克隆形成实验中,经EA处理的瘤细胞克隆形成数明显低于对照组(P<0.05),说明EA能有效抑制U87、U118细胞的增殖。EdU实验中,经EA处理的U87、U118细胞的增殖能力大大减弱。流式细胞术检测细胞周期发现,经100μM的EA处理48h后,U87细胞和U118细胞处于细胞周期S期的细胞数分别增加10.89%、11.54%,而处于G1期、G2/M期的细胞数明显减少,差异显著(P<0.05),说明EA干扰U87、U118细胞的细胞周期进程,使细胞周期阻滞在S期。流式细胞术凋亡检测表明,经100μM的EA处理瘤细胞48h后,U87、U118 细胞的凋亡率分别从(7.58±1.13)%、(9.33±0.27)%上升到(23.49±0.64)%、(19.84±1.06)%,说明 EA 诱导 GBMU87、U118 细胞凋亡。Hoechst33342/PI双染实验发现,EA处理组出现大量呈凋亡形态的细胞。细胞划痕实验中,U87细胞的对照组、50μM的EA处理组划痕的愈合率分别为(51.69±0.29)%,(31.82±0.44)%;U118细胞的对照组、50μM的EA处理组划痕的愈合率分别为(49.75±0.64)%,(29.82±0.69)%;差异显著(p<0.05),说明 EA 能有效抑制GBMU87、U118细胞的迁移。Transwell侵袭实验中,U87细胞的对照组、l00μM的EA处理组透膜细胞数分别为(82±3)个、(31±1)个;U118细胞的对照组、100μM的EA处理组透膜细胞数分别为(97±6)个、(50±4)个;说明EA能有效抑制GBMU87、U118细胞的侵袭。结论:EA能抑制GBMU87、U118细胞的增殖,促进其凋亡,抑制其侵袭。第二部分鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的机制初探目的:探讨鞣花酸(Ellagic acid,EA)抑制胶质母细胞瘤(Glioblastomamultifore,GBM)U87、U118细胞增殖,促进其凋亡,抑制其侵袭的分子机制。方法:应用免疫荧光化学检测对照组和实验组细胞的DNA双链断裂情况;应用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测EA对GBMU87、U118细胞线粒体膜电位的影响;应用明胶酶谱实验检测EA对GBMU87、U118细胞中MMP-9、MMP-2活性的影响;应用Western blot检测EA对GBMU87、U118细胞增殖、凋亡、侵袭等相关基因表达水平的影响。结果:EA通过损伤GBM U87、U118细胞的DNA引起细胞周期阻滞,进而抑制细胞增殖。EA能引起GBMU87、U118细胞的线粒体膜电位下降,导致细胞凋亡。明胶酶谱实验中,100μM的EA处理瘤细胞24h后,U87细胞MMP-9、MMP-2 的活性水平分别下降(78.31±2.53)%、(32.48±1..37)%;U118 细胞 MMP-9、MMP-2 的活性水平分别下降(60.94±4.47)%、(8.99±1.02)%;差异显著(p<0.05),说明EA能抑制GBMU87、U118细胞MMP-9、MMP-2的活性。增殖相关基因Western blot 结果显示,实验组细胞中 PCNA、Ki67、CyclinA2、Cyclin D1、CDK-2、CDK-6的表达下调;凋亡相关基因Western blot结果显示,实验组细胞中Bcl-2的表达下调,而 Cleaved PARP、Bax、Active Caspase-3、DR4、DR5 的表达上调;侵袭相关基因Western blot结果显示,实验组细胞E-Cadherin的表达上调,而Snail、MMP-2、MMP-9的表达下调。而且实验组细胞Akt、p-Akt、Notch1、Notch3的表达下调。结论:EA抑制GBMU87、U118细胞的生长,其可能的分子机制是EA通过调控Akt、Notch信号通路而调节细胞的增殖、凋亡、侵袭等相关基因的表达。第三部分 鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的体内实验研究目的:观察鞣花酸(Ellagic acid,EA)抑制胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)U87细胞异体移植瘤生长的现象,探讨其机制,并评估EA的不良反应。方法:将GBMU87细胞悬液接种在Balb/c裸鼠皮下成瘤,约2周后取出,切碎后二次接种成瘤,造模成功后随机分组,实验组进行EA灌胃,对照组用生理盐水灌胃。观察EA对移植瘤、小鼠体重的影响;对移植瘤行HE染色、免疫组化染色等病理学分析,检测增殖、凋亡、侵袭相关基因的表达水平;同时解剖荷瘤小鼠观察其内脏情况,并进行血常规、肝肾功、心肌酶等血液学分析。结果:EA能明显抑制移植瘤的生长,平均抑制率为37.40%,与对照组相比,差异显著(P<0.05)。HE染色发现实验组肿瘤组织中出现坏死灶、炎性反应减轻、病理性核分裂减少等现象。免疫组化染色发现,实验组肿瘤组织中增殖相关基因PCNA、Ki67、CyclinA2、CyclinD1、CDK-2、CDK-6 的表达下调;凋亡相关基因 Cleaved PARP、Bax、Active Caspase-3、DR4、DR5 的表达上调,而 Bcl-2 的表达下调;侵袭相关基因E-Cadherin的表达上调,而Snail、MMP-2、MMP-9的表达下调。同时实验组肿瘤组织中Akt、p-Akt、Notch1、Notch3的表达下调。实验组和对照组荷瘤小鼠的体重无明显差异;实验组荷瘤小鼠的内脏形态及血液学指标无明显异常。结论:EA通过调节Akt、Notch信号通路抑制U87细胞异体移植瘤的生长,未出现明显的不良反应。