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1,2-氨基醇类化合物是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒制剂等多种具有生理活性药物的合成,因此探索1,2-氨基醇类化合物的高效合成方法对于发展该类药物具有重要意义。与化学法相比,生物法由于其转化率高,立体选择性强,反应条件温和等特点而得到广泛关注。本研究基于新鉴定的Pseudomonas aeruginosa PAK来源的ω-转氨酶(PAKω-TA),设计了一个结合环氧化物水解酶(SpEH)和醇脱氢酶(MnADH)的多酶级联催化体系,从而将较为廉价的环氧化合物一步催化合成具有高附加值的1,2-氨基醇类化合物;为了解决反应过程中的限速步骤,通过RBS优化以提高醇脱氢酶在重组菌中的表达量;另外本研究在该级联催化体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(GluDH),构建了一个封闭的辅酶自循环系统,从而实现辅酶NADP+和辅底物L-Glu的同时再生。(1)以Chromobacterium violaceumω-转氨酶的蛋白序列作为基因探针,在基因数据库中进行BLAST同源性比对,P.aeruginosa PAK来源的“β-消除裂解酶家族蛋白”与C.violaceumω-转氨酶具有64.0%的氨基酸序列同一性,与其他来源ω-转氨酶序列比对结果显示其都具有相同的酶催化活性位点,对其进行克隆并成功表达。酶活力测定结果显示重组酶对(S)-羟基苯乙醛(1c)表现出高的酶活力。考虑到该酶具有高ω-转氨酶催化特性,因此将其重新命名为PAKω-TA并进行纯化,PAKω-TA的酶学性质研究显示,最适反应pH和温度分别为8.0和37℃,为非金属离子依赖酶,对底物(S)-羟基苯乙醛的Km值为0.82 mM。(2)克隆表达SpEH和MnADH,设计一个结合PAKω-TA的三酶催化环氧化物一步合成1,2-氨基醇类化合物的级联催化体系,经过酶催化验证,SpEH可催化50 mM前体底物(S)-环氧苯乙烷(1a)合成(S)-苯基-1,2-乙二醇(1b),进而MnADH催化(S)-1b合成(S)-羟基苯乙醛(1c),最后PAKω-TA催化(S)-1c合成终产物(S)-2-氨基-1-苯乙醇(1d)。转化过程中发现MnADH催化(S)-1b到(S)-1c是一个限速步骤。(3)通过测定MnADH和PAKω-TA不同添加比例时产物生成速率,确定关键酶MnADH:PAKω-TA达到最佳催化反应速率时的最适酶活比例为3:1。利用RBS分析网站,选择不同强度的RBS序列组装到重组质粒pETDuet-mnadh上,并与pakω-ta串联,获得不同RBS强度醇脱氢酶和转氨酶共表达重组菌E.coli/pETDuet-rbs1-5mnadh-pakω-ta,通过酶活测定,最终筛选获得MnADH:PAKω-TA酶活比例达到3:1时的重组菌E.coli/pETDuet-rbs2mnadh-pakω-ta,从而解决了限速步骤的影响。(4)在整个催化体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(GluDH),该策略在MnADH和PAKω-TA之间搭建一个“桥”,从而解决MnADH的辅酶NADP+供应及PAKω-TA的辅底物L-Glu再生问题。将speh与gludh成功串联在pACYCDuet质粒后转入E.coli/pETDuet-rbs2mnadh-pakω-ta中获得四个酶共表达在两个质粒上的重组菌E.coli BL21(SGMP),全细胞转化,可一步催化50 mM(S)-环氧苯乙烷生成49.6 mM的(S)-2-氨基-1-苯乙醇,摩尔转化率达到99.6%。(5)对该转化体系的应用进行拓展,发现重组菌E.coli BL21(SGMP)还可催化(S)-环氧丙烷(2a),(S)-环氧氯丙烷(3a),(S)-环氧丁烷(4a)和(S)-环氧戊烷(5a)这些脂肪族环氧化物生成相应的1,2-氨基醇类化合物,转化率在65.0%-96.4%之间。相比于化学法合成1,2-氨基醇类化合物,该方法具有环境污染少,产品纯度高等特点,为制药行业中1,2-氨基醇类化合物的生产提供了一种有效的方法。