构建辅酶自循环系统全细胞催化环氧化物合成1,2-氨基醇类化合物

来源 :江南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:rockgubao
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
1,2-氨基醇类化合物是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒制剂等多种具有生理活性药物的合成,因此探索1,2-氨基醇类化合物的高效合成方法对于发展该类药物具有重要意义。与化学法相比,生物法由于其转化率高,立体选择性强,反应条件温和等特点而得到广泛关注。本研究基于新鉴定的Pseudomonas aeruginosa PAK来源的ω-转氨酶(PAKω-TA),设计了一个结合环氧化物水解酶(SpEH)和醇脱氢酶(MnADH)的多酶级联催化体系,从而将较为廉价的环氧化合物一步催化合成具有高附加值的1,2-氨基醇类化合物;为了解决反应过程中的限速步骤,通过RBS优化以提高醇脱氢酶在重组菌中的表达量;另外本研究在该级联催化体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(GluDH),构建了一个封闭的辅酶自循环系统,从而实现辅酶NADP+和辅底物L-Glu的同时再生。(1)以Chromobacterium violaceumω-转氨酶的蛋白序列作为基因探针,在基因数据库中进行BLAST同源性比对,P.aeruginosa PAK来源的“β-消除裂解酶家族蛋白”与C.violaceumω-转氨酶具有64.0%的氨基酸序列同一性,与其他来源ω-转氨酶序列比对结果显示其都具有相同的酶催化活性位点,对其进行克隆并成功表达。酶活力测定结果显示重组酶对(S)-羟基苯乙醛(1c)表现出高的酶活力。考虑到该酶具有高ω-转氨酶催化特性,因此将其重新命名为PAKω-TA并进行纯化,PAKω-TA的酶学性质研究显示,最适反应pH和温度分别为8.0和37℃,为非金属离子依赖酶,对底物(S)-羟基苯乙醛的Km值为0.82 mM。(2)克隆表达SpEH和MnADH,设计一个结合PAKω-TA的三酶催化环氧化物一步合成1,2-氨基醇类化合物的级联催化体系,经过酶催化验证,SpEH可催化50 mM前体底物(S)-环氧苯乙烷(1a)合成(S)-苯基-1,2-乙二醇(1b),进而MnADH催化(S)-1b合成(S)-羟基苯乙醛(1c),最后PAKω-TA催化(S)-1c合成终产物(S)-2-氨基-1-苯乙醇(1d)。转化过程中发现MnADH催化(S)-1b到(S)-1c是一个限速步骤。(3)通过测定MnADH和PAKω-TA不同添加比例时产物生成速率,确定关键酶MnADH:PAKω-TA达到最佳催化反应速率时的最适酶活比例为3:1。利用RBS分析网站,选择不同强度的RBS序列组装到重组质粒pETDuet-mnadh上,并与pakω-ta串联,获得不同RBS强度醇脱氢酶和转氨酶共表达重组菌E.coli/pETDuet-rbs1-5mnadh-pakω-ta,通过酶活测定,最终筛选获得MnADH:PAKω-TA酶活比例达到3:1时的重组菌E.coli/pETDuet-rbs2mnadh-pakω-ta,从而解决了限速步骤的影响。(4)在整个催化体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(GluDH),该策略在MnADH和PAKω-TA之间搭建一个“桥”,从而解决MnADH的辅酶NADP+供应及PAKω-TA的辅底物L-Glu再生问题。将speh与gludh成功串联在pACYCDuet质粒后转入E.coli/pETDuet-rbs2mnadh-pakω-ta中获得四个酶共表达在两个质粒上的重组菌E.coli BL21(SGMP),全细胞转化,可一步催化50 mM(S)-环氧苯乙烷生成49.6 mM的(S)-2-氨基-1-苯乙醇,摩尔转化率达到99.6%。(5)对该转化体系的应用进行拓展,发现重组菌E.coli BL21(SGMP)还可催化(S)-环氧丙烷(2a),(S)-环氧氯丙烷(3a),(S)-环氧丁烷(4a)和(S)-环氧戊烷(5a)这些脂肪族环氧化物生成相应的1,2-氨基醇类化合物,转化率在65.0%-96.4%之间。相比于化学法合成1,2-氨基醇类化合物,该方法具有环境污染少,产品纯度高等特点,为制药行业中1,2-氨基醇类化合物的生产提供了一种有效的方法。
其他文献
本文对从美国引种到南京的三种14年生美国红栎纳塔栎(Quercus nuttallii)、水栎(Quercus nigra)和舒玛栎(Quercus shumardii)进行了生长特性及物理力学性能的研究,研究的指标有:纤维形态、生材含水率、生长轮宽度及基本密度、微纤丝角、结晶度、木材密度、干缩性、抗弯弹性模量、抗弯强度、顺纹抗压强度和冲击韧性,对各项指标间进行统计学上的回归分析和相关性分析。其结
疼痛、出血、肛缘水肿、伤口愈合迟缓等是肛周疾病术后常见并发症,如何减少或防治其并发症一直是临床探讨课题之一。中药熏洗疗法历史悠久,源远流长,早在《礼记》中就有“头有疮
《野草莓》是一部重返故地回忆自己整个一生的意识流电影,影片仅用主人公的一天讲述其一生的缩影片段,回忆往昔,借由记忆找寻自我,探寻一种内在的心灵冲突。导演英格玛·伯格
番茄(Solanum lycopersicum)是一种重要的蔬菜作物,在农业经济和粮食生产中占据重要地位。野生醋栗番茄(S.pimpinellifolium)起源于南美洲安第斯山脉,属于短日照植物。经过长期的
目的:对比分析应用开腹阑尾切除术与腹腔镜下阑尾切除术治疗阑尾炎的效果。方法:将2016年12月至2017年8月蒲江通康微创外科医院收治的50例阑尾炎患者随机分为试验组(n=25)和参照
综述了含硒杂环化合物、1,3,5-三嗪修饰和1,2,4-三唑衍生物的合成及重要应用。首次设计并合成了 22个含1,3-硒唑的多种杂环衍生物和14个1,3,5-三嗪与1,2,4-三唑的对接产物,对
目的:观察局部、单次和多次静注(iv)等给药方式对蕲蛇酶药理活性的影响,充分地了解其作用和蛇伤毒理,为其应用及蛇伤救治提供实验资料。方法1.给药方式1)局部给药:以蕲蛇酶溶液棉球湿敷动物出血模型中的创口。2)单次给药:动物静脉单次iv蕲蛇酶。3)多次给药:动物iv射蕲蛇酶,1次/天×7 d。2.测定方法1)采用出血时间测定器法(template bleeding time,TBT)测定小鼠的出血时
对2009年我国硫磺进121情况进行统计,并对国内硫磺销售情况进行分析。2009年我国硫磺进口量为12167.9kt,与2008年相比增加44.60%。进口价格在沉寂了3个季度后,于第四季度展开一波强
2002-10—2005-8,笔者与本院推拿科协作,对70例经补液、中西药物治疗效果欠佳的难治性及少数不愿或不能接受其他治疗的泄泻患儿,采用推拿方法治疗,疗效显著,总结报道如下。
课文《廉颇蔺相如列传》$$人教版语文教材必修四第57页注释(25)“见臣列观(guàn)”表述为:“在一般的宫殿里接见我,意思是不在正殿接见我。列观,一般的宫殿,这里指章台。观,宫廷中高
报纸