食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是我国常见的消化道肿瘤,其恶性程度高、易转移、预后差。ESCC的主要治疗手段包括手术、放疗和化学治疗。由于目前缺乏完善的早期诊断方法,大多数ESCC患者确诊时已为中晚期并伴有淋巴结或远处转移,因此丧失了手术治疗的机会。化疗作为ESCC临床治疗的常用疗法之一,由于肿瘤的异质性及低度敏感性严重影响了化疗疗效,导致患者生存率较低。因此,揭示ESCC细胞转移和化疗敏感性的分子调节机制并探索有应用价值的生物标志物具有重要意义。代谢组学作为基因组学和蛋白质组学的补充,能够更为高效地鉴定出某种疾病所产生的特定代谢谱。近年来,代谢组学已成为揭示疾病发生机制和防治诊断研究的重要途径。尤其是在探索肿瘤发病机制及发展个体化治疗方案中的应用日益普遍,基于肿瘤患者血液、尿液中的特征代谢标志物进行诊断和治疗评估也正向着临床应用方向发展。随着研究的逐步深入,代谢组学在抗肿瘤研究领域必将发挥更大的作用。烟酰胺N-甲基转移酶(Nicotinamide N-methyltransferase,NNMT)是一种N-甲基转移酶家族的胞质酶,以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体,催化烟酰胺及其他吡啶类化合物甲基化,参与烟酰胺平衡以及多种药物和外源化合物的生物转化。近年来,蛋白质组学和基因组学研究发现,与癌旁正常组织相比,在多种不同癌组织中NNMT的表达具有显著差异。已有多项研究报道NNMT在恶性胶质瘤、胰腺癌、肾癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中均存在异常高表达,且与肿瘤细胞增殖、凋亡、周期、迁移、放化疗抵抗等多种生物学表型密切相关。然而NNMT在ESCC中的研究尚未见报道。据此,本课题将通过代谢组学分析鉴定5-FU敏感性不同的ESCC细胞株中的代谢差异,筛选显著差异代谢途径及参与其中的关键分子,进一步探讨关键分子对ESCC细胞5-FU敏感性及细胞表型的影响,并深入探究其作用分子机制,以期为揭示5-FU敏感性分子机制和发展个体化用药提供实验依据。本课题研究内容主要分为三个部分:第一部分:对5-FU敏感性不同的ESCC细胞株进行代谢小分子检测,分析差异代谢途径并筛选差异表达的关键酶,随后分析并验证关键差异基因在ESCC组织(GEO数据库)及细胞株中的表达;第二部分:明确关键差异蛋白在ESCC临床组织样本中的表达并分析与患者临床病理参数的相关性,通过细胞功能实验初步探究该差异蛋白对ESCC细胞增殖、凋亡、周期和迁移的影响;第三部分:通过体外和体内实验深入探究该差异蛋白对ESCC细胞5-FU敏感性的影响,及Warburg效应在此过程中的调控作用。方法第一部分:不同ESCC细胞对5-FU的敏感性分析及细胞代谢差异鉴定1.通过CCK-8检测EC1、Eca109和TE1细胞对5-FU的敏感性;2.对EC1、Eca109和TE1细胞进行基于GC-MS联用技术的代谢组分析,筛选差异代谢途径及关键代谢酶;3.利用GEO数据库中的GSE111011数据集分析NNMT在ESCC临床组织中的表达情况;4.通过q RT-PCR、Western blot分别检测EC1、Eca109和TE1细胞中NNMT m RNA和蛋白的表达差异。第二部分:NNMT在ESCC中的表达及对细胞表型的影响1.免疫组化染色检测30例ESCC患者癌组织及癌旁正常食管组织中NNMT的表达,并统计分析其表达水平与患者临床病理特征参数的相关性;2.采用q RT-PCR和Western blot检测不同ESCC细胞株中NNMT m RNA和蛋白的表达水平;3.选取2株NNMT高表达的细胞株,通过si RNA转染下调NNMT的表达,确定最佳转染浓度和时间,并采用q RT-PCR和Western blot检测NNMT下调效率;4.通过CCK-8法、Ed U染色法检测下调NNMT对细胞存活及增殖能力的影响;5.采用Annexin V-FITC/PI双染法检测下调NNMT对细胞凋亡的影响;6.通过流式细胞术检测下调NNMT对细胞周期的影响;7.通过Transwell、细胞划痕实验检测下调NNMT对细胞迁移能力的影响;8.采用Western blot检测凋亡、周期、迁移及EMT相关标志物蛋白表达的变化。第三部分:NNMT通过Warburg效应调控ESCC细胞对5-FU的敏感性1.通过si RNA、重组质粒转染分别下调、上调NNMT的表达后,采用CCK-8法、克隆形成以及Annexin V-FITC/PI双染法分别检测5-FU对细胞增殖和凋亡的影响;2.分光光度法检测NNMT表达下调/上调及5-FU处理对ESCC细胞葡萄糖消耗、乳酸生成的影响;3.采用糖酵解抑制剂2-DG处理,检测抑制Warburg效应后NNMT表达改变及5-FU处理对细胞生长、葡萄糖消耗、乳酸生成能力的影响;4.采用NNMT干扰慢病毒载体转染TE1细胞后,皮下注射构建裸鼠移植瘤模型,每隔1 d测量裸鼠体重及移植瘤体积,移植瘤体积达到100 mm~3后,每2d进行一次5-FU治疗,连续治疗三周后,处死裸鼠并剥离移植瘤和内脏组织;5.采用q RT-PCR或Western blot检测移植瘤中凋亡相关蛋白和糖酵解关键酶的表达。结果第一部分:不同ESCC细胞对5-FU的敏感性分析及细胞代谢差异鉴定1.CCK-8结果表明TE1细胞5-FU敏感性显著低于EC1和Eca109细胞;2.GC-MS分析结果显示,TE1细胞的代谢模式与EC1和Eca109细胞存在明显差异,TE1与EC1、Eca109细胞共有的差异代谢途径包括烟酸与烟酰胺代谢和TCA循环;3.GSE111011数据集分析结果表明,与正常食管组织相比,烟酸与烟酰胺代谢途径中的关键酶NNMT在ESCC组织中显著高表达;4.与EC1、Eca109细胞相比,NNMT在TE1细胞中显著高表达。第二部分:NNMT在ESCC中的表达及对细胞表型的影响1.与癌旁正常食管组织相比,NNMT在ESCC组织中高表达,且与淋巴结转移具有显著相关性;2.NNMT在EC9706、TE1细胞中高表达,在EC1、Eca109和TE13细胞中表达较低;3.采用浓度为50 n M的si RNA转染EC9706、TE1细胞48h后可显著下调NNMT m RNA及蛋白表达水平;4.NNMT表达下调可显著降低EC9706、TE1细胞存活率和增殖能力,增加细胞凋亡率,使促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低;5.NNMT表达下调后,EC9706、TE1细胞周期阻滞在S期、G0/G1期,且细胞周期蛋白Cyclin D1表达降低;6.NNMT表达下调可显著抑制EC9706、TE1细胞迁移,且上皮标志物E-cadherin表达升高,间充质标志物N-cadherin和Vimentin表达减少。第三部分:NNMT通过Warburg效应调控ESCC细胞对5-FU的敏感性1.下调NNMT显著增强5-FU对TE1细胞存活率和克隆形成的抑制作用,增加5-FU诱导的细胞凋亡率,并且使促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3表达进一步升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达进一步降低,在EC1和Eca109细胞中上调NNMT则作用相反;2.与EC1和Eca109细胞相比,TE1细胞中葡萄糖消耗率、乳酸生成率较高,且糖酵解关键酶HK2、LDHA和PGAM1表达上调;3.在TE1细胞中,下调NNMT可显著降低葡萄糖消耗和乳酸生成,并抑制糖酵解关键酶的表达;与此相反,在EC1、Eca109细胞中上调NNMT导致葡萄糖消耗和乳酸生成增多,且糖酵解关键酶表达增多;4.在EC1和Eca109细胞中上调NNMT后,2-DG处理可显著增强细胞对5-FU的敏感性;5.下调NNMT可显著增加移植瘤对5-FU的敏感性,不同处理方式对裸鼠体重无明显影响;6.下调NNMT后移植瘤组织中糖酵解关键酶的表达显著降低,并且经5-FU治疗后其表达量进一步下降。结论1.5-FU敏感性不同的ESCC细胞代谢差异显著,主要差异代谢途径包括烟酸与烟酰胺代谢和TCA循环;烟酸与烟酰胺代谢途径中的关键酶NNMT在5-FU敏感性较低的TE1细胞中表达显著上调;2.NNMT在ESCC组织中高表达且与淋巴结转移显著相关,NNMT表达下调可抑制ESCC细胞增殖、EMT和迁移能力,诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡;3.NNMT可通过促进Warburg效应降低ESCC细胞对5-FU的敏感性;4.下调NNMT可显著增强5-FU的体内抗肿瘤作用。